高聚物基连续流式PCR微流控芯片系统和应用技术的研究.pdf

摘要 ii皇曼曼曼曼皇量皇曼曼曼曼曼曼曼鼍皇曼曼曼皇曼曼皇曼曼皇!曼曼曼曼曼!!!曼曼!!!曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼曼苎曼曼曼皇曼曼 摘要 PCR(聚合酶链式反应)微流控芯片是一种单元反应界面为微米量级的微型 化学反应系统，具有线性尺寸小、物理量梯度高、比表面积大和流动状态为低雷 诺数层流等特点，可以实现柔性生产、规模放大，以及快速和高通量筛选等功能。 PCR微流控芯片将PCR技术与微流控芯片技术有机地结合起来，实现了DNA 的体外快速扩增，成为微机电系统(MEMS)技术发展的一个重要研究方向。与 常规PCR热循环仪相比，PCR微流控芯片可以缩短反应时间，减少反应试剂消 耗量，增强扩增特异性，而且便于与其他分析和检测设备进行集成。 为了开发一套实用的PCR微流控芯片系统，本论文对以PMMA(聚甲基丙 烯酸甲酯)为基底材料的连续流式PCR微流控芯片系统及其应用技术进行了研 究。采用准分子激光和C02激光直写刻蚀方法在PMMA材料基片表面加工微通 道，通过对工艺参数进行分析与控制，分别加工出横截面形状为矩形、半圆形和 高斯形的微通道，并利用热压键合方法制作出密闭的连续流式PCR微流控芯片。 采用准分子激光直写刻蚀方法加工微通道时，因为准分子激光具有脉冲输出 特性，所以在微通道底部存在由于光斑叠加而形成的周期性刻蚀波纹；采用C02 激光直写刻蚀方法加工微通道时，由于在刻蚀过程中产生的熔融物质重新凝固后 又附着在微通道壁上，所以会在微通道表面形成各种不规则的突起物。本论文利 用准分子激光辐照的方法，对微通道表面进行抛光处理，提高了表面质量，使得 流体能够在微通道中连续地流动，流动时没有气泡产生，显著提高了流动速度的 稳定性。此外，准分子激光刻蚀与辐照方法还可以提高PMMA微通道与基片材 料表面的亲水性，有利于其在PCR微流控芯片中的应用。 为了分析微通道形状与流体在其内部流动状态之间的关系，以及温度变化的 影响，本论文基于计算流体力学方法，对流体通过具有不同形状横截面的微通道 时的流动状态进行了数值模拟研究。由于微通道尺度小，流速较低，所以流体在 微通道内的流动呈层流状态，流速分布不均匀，在微通道中心处的流速最大，这 种现象有利于PCR混合液在流动过程中的扩散与混合；微通道横截面形状的不 同会导致流体速度场中不同速度的相对分布比例不同；温度变化导致的流体粘度 改变，对流体流动状态的影响可以忽略不计；而流体在微通道中的压力降随着流 速的增加而增大，随着温度的升高而减小；流体在微通道内的压力降会受到微通 道横截面形状的影响，当水力学直径相同时，使用具有较大横截面面积的微通道 (高斯形)更有利于降低流动的摩擦阻力，减小压力降，增强流体的流动性和稳 定性。 本论文对连续流式PCR微流控芯片系统的整体结构进行了改进与完善，设 计了竖插式的进样接口，减少了接口处的死体积，减小了因通道尺寸变化造成的 北京T业人学丁学博}：学佗论文 流速不稳定；采用新型接口密封形式提高了接口密封材料的使用寿命，延长了芯 片的使用时间，稳定了实验条件；对温度控制系统进行参数优化，改善了芯片的 温度分布特征，通过添加隔热挡板，增强了不同温区之间的隔热效果；搭建了一 套适用于连续流式PCR微流控芯片的简易气动进样装置，该装置没有死体积， 减少了样品用量，可以灵活控制PCR混合液在微通道中的流动速度，而且能够 实现液滴式的多样品间断进样，有助于实现多样品的连续扩增。 最后，本论文利用经过改进后的PMMA基连续流式PCR微流控芯片系统对 长度为400bp的DNA模板进行扩增实验，并对扩增参数进行了优化。在扩增时， PCR混合液中应添加一定浓度的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶液，对PMMA微通 道表面进行动态钝化改性处理，以减少PCR混合液中聚合酶在微通道表面的吸 附，从而确保扩增反应的顺利进行，但是在本论文中PVP溶液的浓度对钝化效 果的影响并不显著；在进行PCR微流控芯片的微通道排布结构设计时，延长预 变性通道以及增加变性通道和退火通道的长度，有利于DNA模板的充分变性和 退火时引物与模板的完全复性，能够提高扩增效率；合理控制PCR混合液在微 通道中的流动速度与温度循环次数，可以获得更好的扩增结果；由于高斯形横截 面的微通道内流体速度场分布较差，造成PCR混合液在各阶段反应的时间存在 微小差别，所以其扩增效果略差于微通道横截面为