手足口病重要病毒序列分析及其生物信息学表征.pdfVIP

手足口病重要病毒序列分析及生物信息学表征 研究生：任倩 专业：病原生物学 导师：张忠教授 张乐海副教授 中文摘要 目的 手足口病是一种流行性传染病，多由肠道病毒引起，症状主要表现为手、足和口 腔粘膜的疱疹，多数是良性、自限性疾病，也可出现心、肺和神经系统等严重并发症。 我们利用对肠道病毒具有较高特异性的兼并引物和自行设计的分型引物，检测手足口 病患儿咽拭子标本，同时，通过肠道病毒基因组VPl编码区序列的测定和分析，研 究手足口病病原体检测和分型方法，掌握其遗传进化特征。 人类肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，该属包括脊髓灰质炎病毒、柯萨 奇病毒、埃可病毒和肠道病毒，其中肠道病毒71型是引起手足口病最重要的病原体， 由其引起的手足口病症状较重，常伴有无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹 等并发症，严重者甚至会导致死亡。该病毒存在较明显的变异和重组现象，因此到目 前为止仍没有很好的预防和治疗方法。本课题通过对肠道病毒71型VPl区序列及全 基因组序列的分析，研究肠道病毒71型的变异、重组规律，为疫苗的研发、药物靶 位的筛选及防控策略的完善等提供理论基础。 对手足口病CvAl0vPl蛋白的生物信息学研究，分析和预测该病毒VPl蛋白的理化 特性、空间结构以及该蛋白的B细胞抗原表位。 方法 1．标本采集 标本采集自山东大学齐鲁儿童医院住院手足口病患儿的咽拭子标本。标本加入适 当生理盐水，剧烈振荡洗下咽拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，自然沉淀后吸 取上清液，加入适量抗生素，置4℃条件下，备用。 2．I矾A提取 采用北京天根公司病毒RNA提取试剂盒，按说明书进行。提取的RNA溶于60ul RnaSe．丘ee ddH20中，直接用于RT-PCR或置一20℃以下低温保存。 3．肠道病毒分子鉴定 用肠道病毒通用实时荧光RT-PCR核酸检测试剂盒同时分别进行肠道病毒属、 EV71和CVAl6型进行分子鉴定。 4．肠道病毒VPl编码序列分析 (1)引物设计 合成对肠道病毒VPl区37端序列具有较高特异性的兼并引物040—01l，同时通 (2)RT-PCR扩增 苷酸序列。 (3)DNA纯化 琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，利用北京天根公司琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒对DNA进行回收、纯化。 (4)序列测定和分析 5．2．2和BioEdit 回收后的DNA进行序列测定。采用生物信息学软件DNAMAN 7．0．9．0进行序列比对并构建系统进化树。 5．EV71基因组重组分析 v3．5．1，对EV71基因组进行重组分析。 使用基因重组分析软件RDP和Sinlplot 6．CVAlOVPl蛋白生物信息学分析 (1)CVAl0VPl蛋白二级结构预测 白的二级结构(无规卷曲、D一片层、Q一螺旋和p一转角)。 (2)CVAlO VPl蛋白三级结构预测 预测VPl蛋白的空间构象并建模。 (3)CVAlO VPl蛋白亲水性、柔韧性、表面可能性和抗原表位预测和分析 J锄eson—Wblf对氨基酸的亲水性、柔韧性、表面可能性及抗原指数进行单参数分析。 (4)CVAl0 VPl蛋白抗原表位综合分析 验证表位预测结果。 结果 100％。在进化关系上，它们与EV71C4a亚型的同源性较高，核苷酸同源性为90．8％一 98．8％，故而属于C4a亚型。 2．2个CvAl6济南分离株核苷酸和氨基酸同源性较高，分别为97．7％和96．8％。 它们与CVAl6 B1b亚型的同源性较高，核苷酸和氨基酸的同源性分别为90．5％一95．5％ 和96．8％．100％。Ⅲ．c07和Ⅲ．B11与大部分毒株相比，无氨基酸变异位点出现。 有5例为CVAl0，1例为CVA6。其