7蛋白质化学5结构与功能及研究方法.ppt

蛋白质芯片筛选新药的原理 受体、酶的微点阵 与中草药抽提物反应后再与受荧光标记的配体或底物结合 以激光进行检测 不出现荧光的点表明中草药样品中含有与这些点上的蛋白质相互作用的物质，因此是作用于这些位点的新药候补。 荧光 基因芯片操作程序 经典的DNA芯片数据 DNA芯片的操作过程 利用半导体技术的DNA芯片 酵母双杂交(Yeast Two Hybrid) 技术 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础。随着分子生物学技术的发展，特别是人类基因组计划的完成，使人类对基因的结构和功能的认识不断加深，但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题。酵母双杂交系统利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白质。 酵母双杂交的原理 利用酵母作为真核蛋白质相互作用的模型 利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白 通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用 使用不同的培养基筛选阳性克隆 酵母双杂交由Fields 等在1989 年提出，是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain，AD)。DNA-BD 能够识别位于GAL4 效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS)，并与之结合。而AD 则是通过与转录机构(transcription machinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 酵母双杂交体系 UAS: Upstream activating sequence, 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白质－蛋白质的相互作用。主要有二类载体: a. 含DNA -binding domain的载体; b. 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence, NLS)， 而GAL4-ad没有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 另一个重要的元件是报道株，报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易与来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 　 酵母双杂交模型 DNA-Binding Domain 诱饵蛋白 Bait Protein 捕获（猎物）蛋白 Prey Protein Transcription Activating Region Reporter Gene DNA-Binding Site 模 型 文库筛选的步骤 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒。 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母。 再将文库质粒转化到酵母中。 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。 转基因动物 Transgenic Animals 什么是转基因动物 将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中，接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育，移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代细胞中都携带有转入的外源基因，利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系-转基因动物。 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过