凡纳滨对虾与WSSV侵染相关细胞与基因功能分析.pdf

万方数据 万方数据 凡纳滨对虾与WSSV 侵染相关的细胞与基因功能分析 摘要 对虾白斑综合征病毒（WSSV）自20 世纪 90 年代出现后，成为对虾暴发性流 行病的主要病毒性病原，给水产养殖业造成巨大的经济损失。 WSSV 是一种有囊膜病毒，其感染宿主细胞的第一步是囊膜与靶细胞膜的吸 附，而后融合或者内吞进入细胞，完成对细胞的侵染，现已有多个蛋白被报道参 与感染，但该病毒感染的分子机制尚不清晰，也没有有效的防治手段。本论文围 绕解析 WSSV 感染宿主的分子机制为主要研究目的，分别从 WSSV 多个囊膜蛋白和 凡纳滨对虾重要造血功能相关的转录因子 Runt 基因入手。通过荧光显微镜观察 WSSV 各囊膜蛋白是否能引起宿主细胞的内吞作用。并使用荧光微球技术，通过 已知的受体蛋白对WSSV 囊膜蛋白的细胞内吞抑制实验，进一步验证与 WSSV 感染 相关的各蛋白之间的相互作用关系。同时研究凡纳滨对虾转录因子 Runt 在受到 外界病原侵入后的表达变化，以及重组蛋白注入对虾体内对感染 WSSV 病毒后的 相对保护情况。 通过本论文的研究，以期为阐明 WSSV 的侵染机制及途径奠定基 础。 本论文的主要研究内容包括以下五个部分： 1、WSSV 囊膜蛋白介导细胞内吞实验：FITC 标记的重组 WSSV 囊膜蛋白 VP24，VP26， VP28，VP31 和 VP37 介导凡纳滨对虾不同组织细胞的内吞作用鉴定。原代培养凡 纳滨对虾的血淋巴，淋巴器官，上皮组织和造血组织细胞，在体外迁出后，和 FITC 标记的重组囊膜蛋白孵育，通过荧光显微镜观察发现，可以使血细胞发生 内吞作用的有VP24，VP28，VP31 和 VP37；可以使淋巴器官细胞发生内吞作用的 有 VP28 和 VP37；可以使甲壳下表皮细胞发生内吞作用的有 VP28，VP31 和 VP37； 使造血组织细胞发生内吞作用的有 VP24，VP28 和 VP37。综上所述，VP28 和 VP37 均能单独介导宿主细胞发生内吞作用，在 WSSV 的侵染过程中发挥首要的入胞作 用。 2、应用荧光微球技术研究凡纳滨对虾血淋巴细胞与偶联荧光微球的重组 WSSV 囊膜蛋白的相互作用，并探究 AK，Rab7 和 BP53 以及多克隆抗体对 VP31，VP28 和 VP37 进入细胞的影响作用。运用 EDC 法偶联荧光微球和重组囊膜蛋白，通过 流式细胞术检测，结果显示 BP53 对 VP37 进入血细胞有抑制作用，而 Rab7 和 AK 万方数据 对 VP28 和 VP31 进入血细胞没有起到抑制作用。VP28 和 VP37 的多克隆抗体对 VP28，VP37 进入细胞有明显抑制作用，而对 VP31 抗体对 VP31 进入细胞没有抑 制作用。说明血细胞对囊膜蛋白 VP31 的内吞存在非特异性。通过实验结果，我 们可以推论，BP53 作为VP37 的受体在病毒侵染细胞过程中发挥重要作用，而Rab7 可能作为一种细胞因子，与 VP28 相互结合参与信号转导并调节感染过程。 3、凡纳滨对虾 Runt 转录因子 cDNA 全长序列克隆：应用反转录和 cDNA 末端快速 扩增（RACE）技术，首次在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆并测序了 一种 Runt （lvrunt）基因全长。lvrunt cDNA 全长 1754bp，含有 1 个 663bp 长 的开放阅读框，编码 221 个氨基酸，理论分子量为 23.6 kDa，具有 Runt-family 结构域。对该基因的蛋白序列分析显示，Lvrunt 的氨基酸序列与软尾太平喇蛄 （Pacifastacus leniusculus）相似度为88.1%，与其它种类的氨基酸序列相似 性在 30%—52.4%范围内，该蛋白表现较高的种间保守性。 4、lvrunt 在凡纳滨对虾的组