采用X射线衍射解析人鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子（RalGDS）Ras结合结构域的空间结构.pdfVIP

第43卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第6期 2015年 6月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 893—898 DOI：10．11895／j．issn．0253~820．150102 采用 X射线衍射解析人鸟嘌呤核苷酸解离刺激 因子 (RalGDS) Ras结合结构域的空间结构 黄雪英 雷 明 沈 阳 张 巍 刘艳丽 刘 珂 赵浩斌。 祁 超 (华中师范大学化学学院，武汉 430079) (华中师范大学生命科学学院湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室 ，武汉430079) (多伦多大学结构生物学中心，加拿大M5G1L7) 摘 要 Ras结合结构域(RBD)是鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)家族成员D端的高保守区，通过它 连接 Ras和Ras相关蛋白。利用 RedWings和SGC-1screens相关的悬滴法设盘结晶，按体积比1：1加蛋白液 到含 1：100胞 内蛋 白酶Glu—C(w／w)的结晶溶液 (2mol／L (NH4)2SO4，0．2mol／LNaAc，0．1mol／LHEPES， 5％MPD，pH7．5)中，晶体3天长成可组装大小。利用x．射线晶体衍射技术解析了人RMGDS的Ras结合域 (RMGDS—RBD)的晶体结构 ，对比鼠和人RalGDS—RBD，主要是 Ras结合区的C-端不同。人RalGDS-RBD通过 Glu 和Glu 在RalGDS和Ras蛋白间形成氢键，而在同一位点，鼠RMGDS-RBD通过Asp820和Asp82：形成氢 键。人RalGDS—RBD结构中含届B 一型三维结构的泛素样构象，一个单体的 C一端残基与相邻单体的 折 叠形成平行 结构。 关键词 鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)；Ras结合结构域(RBD)；Ras蛋白 1 引 言 Ras蛋 白是一类小型GTP-结合蛋 白，能作为分子开关耦合细胞外信号，从而调控不同的细胞应答。 细胞信号通路中，Ras蛋白表现为无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式两种构象。通过两 种构象之间的转换，调节细胞生长、细胞流动性及细胞增殖…。在 GTP结合区，Ras蛋白通过与Rafs丝 氨酸／苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇3一激酶(PI3一kinase)、Ral鸟嘌呤核苷酸置换因子 (Ral—GEFs)等效应分子 结合，激活类似的通路 。鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)家族四个成员(RalGDS、RGL、RGL2／ Rlf和 RGL3)含部分相 同结构，均含一个带上游 Ras交换锚的中央CDC25同源结构域和一个 C．端 Ras／ Rap同源结构域(RBD)(图1A)。通过 c一端RBD，RalGDS蛋白结合 Ras及 Ras相关蛋白。 目前，已利用核磁共振和x衍射法分析了RBDs的三维结构 J。虽然RalGDS家族各成员RBDs 残基没有明显的序列同源性，但它们的三维结构非常相似 ，各 RalGDS—RBD含泛素样构象(呈 型三级结构特征)，但 Ras结合 区和疏水核心 -5]却存在结构差异。这些特点导致 RalGDS．RBDs与 Ras／RaplA的不同结合。从 Rap和 Ras效应区的突变情况来看，残基 31对 Ras／Rap特异性结合 Raf- RBDs至关重要。。。虽然 鼠和人RBDs有很高的全序列同源性和结构相似性，但与Ras蛋 白结合的鼠 RalGDS-RBD和人 RalGDS-RBD残基还是有一些不同。经最关键 的Raf途径，Ras介导正常鼠细胞致 瘤 ；经关键 的Ral—GEFs途径，Ras介导正常人细胞致瘤 ’。鼠RalGDS．RBD的空间结构虽然早 已解 析，与人RalGDS—RBD的空间结构相似性较高，但还是有种属差异。以鼠RalGDS．RBD为靶标研究Ral— GDS—RBD引起的相关疾病 ，并根据鼠RalGDS．RBD的空间结构及作用机制为人设计药物就会有较大误 差。因此，为更好地了解人 RalGDS-RBD特异性结合 Ras蛋 白的结构基础 ，本研究制备了人 Ra