柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法的建立及应用.pdfVIP

热带作物学报 2015，36(6)：1153—1160 ChineseJournalofTropicalCro 柑橘溃疡病菌 LAMP实时浊度检测方法 的建立及应用 封立平 ，孔德英2，孙 涛2，孙 冬 ，纪 瑛 ，王 简 1山东出入境检验检疫局检验检疫技术 中心 ．山东青岛 266002 2重庆出入境检验检疫局检验检疫技术 中心 ．重庆 400020 摘 要 以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋 白基 因(登录号：AE008923．1)为靶标 ，设计并筛选 4条引物来特异 性识别靶标序列中的6个独立区域 ．建立柑橘溃疡病菌 LAMP实时浊度检测方法 。该方法利用实时浊度仪检测 反应过程 中产生 的焦磷酸镁 白色沉淀 ．实现对 LAMP整个反应过程 的实时监控 。从镁离子浓度 、甜菜碱浓度 、 dNTPs浓度 、引物浓度和反应温度 5个变量参数对 LAMP检测体系进行优化 ，并对方法 的特异性、灵敏度 、稳 定性及实际样品检测效果进行评价 结果显示 ．该体系经优化后稳定性 良好 ，可在 66℃ 恒温条件下 ，60min 内完成检测 ：DNA检测下 限可达 0．02ng／IxL．灵敏度与荧光定量 PCR方法相 同，比常规 PCR方法高 1个数量 级；能快速 、准确地对 田间疑似样 品进行检测 ，与荧光定量 PCR方法 的检出情况一致 ，没有漏检 。结果说 明柑 橘溃疡病菌实时浊度 LAMP检测方法操作简便 、所需时间短 ，特异性与灵敏度高，为柑橘溃疡病菌的快速筛查 提供较好的途径 关键词 LAMP实时浊度检测方法 ：柑橘溃疡病菌：检测 中圈分类号 S436．661．1 文献标识码 A Rapid Detection ofXanthomonasaxonopodispv．citri by LAM P Real-time Turbidity M ethod FENG Liping，KONG Deying~，SUN Tap，SUN Dong，JIYing，WANG Jian 1TechnicalCenter,ShandongEntry-ExitInspectionandQuarnatineBureau,Qingdao，Shandong266002，China 2TechnicalCenter,ChongqingEntry-ExitInspectionandQuarnatineBureau,Chongqing,400020,China Abstract The conserved hypothesis protein sequence published in GenBank faccession no．AE008923．11 of Xanthomonas axonopodis pv．chriwas used to design a setoffour specialprimers thatrecognized six distinct sequencesofthe conserved region ofX．axonopodispv．citrigenome，and a real-time turbidity method forrapid detection ofX．axonopodispv．citriby loop—mediated isothermalamplification fLAMP1was established．Real—time monitoring ofmagnesium pyrophospbate produced from the LAMP reaction was achieved by the turbidimeter．，nle LAMP detection system was optimized by five variable parameters： magnesium ion concentration． dNTPs concentration，betaine concentration，prim