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药用植物细胞悬浮培养生产 次级代谢产物的研究 1.植物细胞悬浮培养 1.1.定义 1.2.原理 1.3.发展 2.次级代谢产物 2.1.定义 2.2.原理 2.3.发展 2.4.实例 2.5.优缺点 1.1.定义 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。【1】 1.2.原理 植物细胞悬浮培养 （plant cell suspension culture） 是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。【1】 用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。 大多实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。 1.2.1.悬浮培养的特点 (1). 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 (2). 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。 1.2.2.植物细胞悬浮培养系统要求 ①细胞培养物分散性好，细胞团较小； ②细胞形状和细胞团大小均匀一致； ③细胞生长迅速。【2】 1.2.3细胞悬浮培养的建立 1.2.4.愈伤组织的诱导 选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。 选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加物质 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎 1.2.5.悬浮系的建立与培养 悬浮培养的基本形式 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中，最后一次收获的培养方式。 2.连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持稳定。【3】 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物(菌体和代谢产物) 1.2.5.1.分批培养/成批培养（Batch culture） 特点 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。 继代的方法 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 最佳继代时期 了解细胞数目增长变化S形曲线后，选择对数生长期和直线 生长期！ 注意事项 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。[4] 1.2.5.2.连续培养 特点 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。 开放式和封闭式区别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法（离心）收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加 开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定 通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上 连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速浓度－细胞生长的影响）； 次级物质的大量生产。 成功的悬浮细胞培养体系特征 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加一倍。【5】 悬浮细胞生长量的计算 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重 培养细胞活力的测定 1.相差显微术法 2.伊凡蓝法 3.FDA法（荧光素双醋酸酯法） 影响悬浮细胞生长的因素 起始愈伤组织的质量 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。 培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。 影响悬浮细胞生长的因素 培养基 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。 基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基设计时,一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。 植物激素和其他附加成分的应用。 影响悬浮细胞生长的因素 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养 温度： 最适25℃ 继代周期 指具有一定起始密度的细胞,从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。 继代培养（Subculture）：