目的基因的分离课程.ppt

目的基因的分离 分离目的基因的方法及原理 目的基因分离方法的选择原则 目的基因的序列测定 目的基因的定义： target gene 对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究 或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因， 此基因（或片段）称为目的基因。 外源性基因（或DNA）： cloned DNA in vitro 插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。 DNA重组技术： 按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中 扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 目的基因的来源 从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA 片段要求 ①纯度高；②数量多 原核细胞（较易获得目的基因） 基因组较小，可直接分离获得 基因组 限制性内切酶 水解成若干 片段 探针筛选 提纯 扩增 真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组的 10-5甚至更少，不易获得。 真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择 1. 构建 cDNA文库 2. 构建基因组文库 3. 人工合成 Synthesize DNA in vitro 4. PCR扩增 DNA文库： 通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。 区域特异性cDNA文库 从特定位点的基因组DNA出发寻找转录序列 即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离RNA,反转录合成cDNA 组织特异性cDNA文库 从cDNA出发寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。 即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取RNA，构成cDNA文库。 可得到特定细胞的外显子图谱 一、构建cDNA文库 1.真核细胞mRNA的分离和纯化 提取细胞内总RNA 分离和纯化mRNA mRNA 3’端有polyA尾，用oligo-dT纤维 素亲和柱分离纯化mRNA。 3.构建cDNA文库 （1）修饰cDNA两端 接头：人工合成的双链寡核苷酸， 二端均为平头或含酶切位点。 衔接头：一端为平头，一端为粘末端。 （2）cDNA与载体相连 各cDNA各自与一个载体在T4连接酶 作用下以粘末端互相连接，即为重组DNA 分子。 （3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培 养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆 体，以保证它们的遗传性状相同。 4.筛选目的基因 二、构建基因组文库 1. 分离纯化基因组DNA 条件应温和，以保证得到较长的DNA链 2. DNA片段与载体连接 基因组DNA 酶水解 具一定长度的片段 （粘性末端） 载体（噬菌体等） 酶解 与目的基因连接 3.导入宿主细胞： 携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经 包装后转入宿主细胞内培养扩增。 插入基因组片段的集合体即基因组文库。 4. 筛选目的基因 原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。 原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目的基因。 三、人工合成目的基因DNA片段 1. DNA的化学合成 2. DNA的酶促合成（首先需要有目的基因 DNA或与之互补的RNA链作为模板） 四、聚合酶链反应合成DNA片段 （见PCR章） 五、其他方法 1. 构建差示文库(differential library) 差示文库构建流程 2.mRNA差异显示(differential display) (1) PCR扩增 (2) 电泳分离（测序胶） 第二节 目的基因分离方法的选择原则 一、根据获得目的基因的目的选择方法 基因组文库 基因组全部测序、结构分析、基因识别，需构建基因组文库，从中获得基因（HGP）。 cDNA文库 研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于生物制药等。 差异显示 对比某一种或几种变异的基因（差异）。 二、根据目的基因的特点选择方法 基因组文库： cDNA文库： P C R： 三、根据实验室的设备和条件选择方法 第三节 目的基因序列测定 一、双脱氧链终止法