环介导等温扩增技术.ppt

环介导等温扩增技术 胡星星2015.10.20 主要内容 定义 原理 操作步骤 优缺点及 定义 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚合酶短时间（通常1h）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。 其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快速检测的方法。 原理 扩增启动阶段 FIP F3 （5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离）的单链 BIP B3 （8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游离和Bc1末端即5’端游离）的单链 循环扩增阶段 FIP F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10）和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）； BIP B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环扩增。 延伸循环步骤 产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的折叠结构的DNA 的混合物。 LAMP法实验室常规操作步骤 优缺点 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。  应用 LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境监测、食源安全等领域，具有更为广阔的发展应用前景。 Calcein钙黄绿素，荧光指示剂，与Mn2+络合后不发荧光，扩增反应后产生Mg2P2O7夺取与钙黄绿素结合的Mn2+,形成MnP2O4， * Calcein钙黄绿素，荧光指示剂，与Mn2+络合后不发荧光，扩增反应后产生Mg2P2O7夺取与钙黄绿素结合的Mn2+,形成MnP2O4， *