cDNA文库与EST序列分析ppt.ppt

cDNA文库构建及EST序列分析 陈威、丁立建、黄显军、刘振英、毛海花、上官巧灵、朱竹君 （按姓氏首字母排列，排名不分先后） 目录 ——黄显军 cDNA基因文库： 某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 1. cDNA文库背景简介 1.1 cDNA文库产生前的技术概况 随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。 在过去寻找新基因的方法有： a）消减杂交 b）mRNA 差异显示 c）cDNA 的代表性差异显示分析法 d）差异消减展示等方法 这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。 1.2 cDNA文库的产生 由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多的方法主要是 cDNA 文库的筛选。 一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。 另一方面由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。 所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。 1.3. 为什么要构建cDNA文库？ cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。 1.4. 怎么构建cDNA文库？ 1.5. cDNA文库构建后能干什么？ 1)可保护濒危珍惜生物资源 2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针 3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究 1.6. cDNA文库的优势及价值 1）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。 2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。 2. EST序列分析背景简介 克隆全长cDNA序列的传统途径： a)噬斑原位杂交的方法 b)采用PCR的方法 缺点：工作量大、耗时、耗材 这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。 2.1. EST序列分析的产生 随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前。 采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。 2.2. EST技术的作用价值 EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。 Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。 目录 EST序列分析 原理 方法 应用 原理 ESTs（Expressed?Sequence?tags?）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。 方法 分析EST序列的目的 获得EST序列的方法 分析EST序列的方法 如何提交EST序列 分析EST序列的目的 基因识别 获得全长cDNA 研究基因可变剪接类型 SNP的发现 表达量比较 获得EST序列的方法 从数据库下载