利用HRM-PCR方法及研究OAS1基因SNP丙型肝炎易感性之间相关性.pdf

·中文论著摘要· 炎易感性之间的相关性 目 的 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒感染引起的主要经血液传播的疾病，呈全球性分 布，患病人数约占全球人口的3％，已成为全世界慢性肝病及死亡的主要原因之 一。感染丙型肝炎病毒以后，无论是对肝脏造成的损伤程度、发展成肝硬化或肝 细胞癌的进程还是对药物治疗反应，个体差异均很大，说明宿主的遗传因素，特 别是SNP对于丙型肝炎这些临床表现及转归起到关键性的作用。 2’．5’寡腺苷酸合成酶(OAS)被认为是最早发现的一组由干扰素诱导产生的 抗病毒酶类之一。通过OAS／RNaseL途径，促进病毒mRNA降解和受感染细 胞凋亡，在干扰素抗病毒过程中发挥重要作用。OASl基因SNP与一些病毒感染 性疾病易感性之间存在相关性，如SARS病毒、西尼罗河病毒等，而探讨该基因 SNP与丙型肝炎易感性之间是否也存在一定的相关性是本研究的主要目的。 材料和方法 l、研究对象 本研究采用病例对照研究方法，选取2009年11月至2011年4月在中国医 科大学附属第一医院就诊的汉族丙型肝炎患者298例，根据2004年《丙型肝炎 预防指南》确定入选标准为：抗HCV阳性，实时荧光定量PCR检测 HCV-RNA5．0x102 IU／ml，并通过血清学检查排除其他肝炎病毒所致的肝炎。其 (56．92A：12．46)岁。 对照组为305名中国医科大学附属第一医院同期汉族健康体检者或无病毒 性肝炎史的其他疾病患者，男性210例(68．9％)，女性95例(31．1％)，年龄范 围30．84岁，平均年龄(57．63士11．18)岁。丙型肝炎组和对照组在性别和年龄构 成上差异均无统计学意义(分别为P=0．99和P=0．21)。 2、基因组DNA的提取 Micro 采用QIAamp⑩DNAKit(QIAGEN)进行外周血基因组DNA提取， 具体操作步骤按照其说明书进行。用核酸定量仪调整DNA的终浓度为30ng／1．tl， 并冻存于．80℃备用。 3、OASl基因SNP的检测 0774671、 采用HRM．PCR结合混样法对研究对象OASI基因m2660、倦1 璐3741981 SNP进行检测。结果在LightCycler@480基因扫描软件上进行分析。 4、测序验证 为证实HRM．PCR结果的准确性，随机抽取20份PCR产物进行测序。 5、蛋白分子三维结构分析 ProteinData 以RCSB Bank蛋白数据库中的OASI蛋白三维立体结构(PDB Viewer软件进行蛋白分子 构建本实验样本的蛋白三维立体构象，通过Swiss．Pdb 三级结构的分子和氨基酸残基的突变分析。 6、统计学分析 4．0软件 SNP的基因型频率和等位基因频率通过计数得到。运用Haploview 17．0 进行Hardy-Weinberg平衡检验、连锁不平衡检验及单倍型分析。采用SPSS 软件进行统计学分析：组间等位基因频率和基因型分布差异采用卡方检验；多态 性位点与丙型肝炎患病风险之间的相关性用比值比(OR)及其95％可信区间(CI) 表示。所有统计检验均为双侧概率检验，P0．05为统计学检验具有显著性差异。 牯 里 ：口7卜 l、OASI基因SNP的筛查 准确性，随机抽取20份PCR产物直接测序，测序结果与HRM．PCR结果完全一 致，说明HRM．PCR分型结果可靠。 2、遗传平衡检验 将丙型肝炎组及对照组人群的基因型频率分别进行了遗传平衡检验，X2检 2 验结果显示观察值和期望值均吻合良好，符合Har