干扰素γ诱导蛋白10基因及肿瘤抗原修饰树突状细胞抗前列腺癌实验与研究.pdf

中文摘要 中文摘要 干扰素丫诱导蛋白10基因与肿瘤抗原修饰 树突状细胞抗前列腺癌实验研究 H的： 1．构建干扰素Y诱导蛋白lO(IFN-3,inducible protein一10，IP一10)真核表达质粒 (IP—10／pcDNA3．1)并大量制备。 cell，DC) 2．建立从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic 的方法：研究DC发育、分化和成熟过程中形态、结构以及免疫生物学特性 的改变；探讨影响DC增殖、分化的有关因素。 癌免疫治疗作用及免疫保护作用。 方法： 表达载体并转化、抽提和纯化。分离骨髓前体细胞，在细胞因子GM—CSF和IL．4 marrowderived 联合作用下，经手法筛选，大量制各骨髓DC(bone DC，BM．DC)。 采用形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学(FCM)以及免疫生物学(MLR)等 方法研究DC的生物免疫学特性。将RM．1前列腺癌细胞的裂解产物负载DC后， 通过脂质体转染法将IP，10基因导入DC，制备IP．10／Lysate—DC前列腺癌瘤苗； RT-PCR和Westernblot检测转染DCIP．10的表达，测定转染DC上清对T细胞 的趋化指数，检测DC瘤苗刺激T细胞的增殖以及诱导特异性CTL的杀伤作用。 建立小鼠RM．1前列腺癌模型，观察该瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用：预先应 用瘤苗接种小鼠后，以RM．1细胞攻击小鼠，观察瘤苗诱导的免疫保护作用； ELISA方法检测接种DC瘤苗小鼠CTL的IL一2和IFN-y表达水平。 结果： 1．所构建的IP—10／pcDNA3．1表达质粒，经酶切电泳和DNA正、反向测序鉴定， 证实重组质粒构建正确，插入片断包含IP．10基因序列和单核细胞趋化蛋白1 信号肽基因序列。 中文摘要 只小鼠的骨髓前体细胞中获得5～10×106个DC。形态学观察可见，培养早 期的DC突起少而短，胞内有许多囊泡，细胞器少；细胞表面低表达B7分子 和MHC分子，刺激T细胞增殖能力极弱，但吞噬能力强；培养7天时，细 胞呈现典型的DC形态，表面伸出许多树枝样突起，胞内囊泡结构减少．细 胞器成分增加，吞噬功能减弱，但B7分子和MHC分子表达明显上调，能强 烈刺激T细胞增殖。GM—CSF加IL．4组的DC得率及细胞功能均明显高于 GM—CSF组。 3．将RM—l前列腺癌细胞的裂解产物负载培养5天后的DC，通过DOTAP脂质 达明显增强，其细胞上清对T淋巴细胞有显著趋化作用。 4．混合淋巴细胞反应显示，IP—10／Lysate．DC瘤苗刺激同基因型小鼠脾脏T细胞 增殖能力明显提高。四氮唑蓝(MTT)还原法检测显示，用负载RM．1细胞 对RM一1肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，但杀伤作用明显低于IP一10／Lysate．DC 免疫组小鼠，差异有显著性意义(pO．01)。 5．RM一1前列腺癌荷瘤小鼠模型构建成功，成瘤率为100％。体内实验显示， Lysate．DC治疗组小鼠肿瘤生长减慢，生存期延长；应用IP一1o／Lysate—DC的 治疗作用较Lysate．DC进一步增强，接种RM．1肿瘤细胞75天后， 6．组织学检查发现，经IP．10／Lysate．DC瘤苗治疗的小鼠，肿瘤组织局部坏死明 显，在瘤体周围和瘤体内有大量炎细胞浸润，Lysate．DC治疗组也可见较明显 的炎细胞浸润，但少于IP．10／Lysate—DC组。 7．免疫保护实验发现，经IP一10／Lysate-DC免疫的小鼠接种RM．1肿瘤细胞后， 肿瘤生长缓慢，小鼠生存期延长，在RM．1细胞攻击后75天，经 护作用，但明显弱于IP一10／Lysate—DC，免疫小鼠只有17％无肿瘤生长，差异 有显著性意义(DO．05)。 05)。 表达水平明显升高，