哈维氏弧菌超氧化物歧化酶原核表达免疫原性与研究.pdfVIP

哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究 摘 要 哈维氏弧菌是一种有运动性，短杆的革兰氏阴性海洋细菌，由于它有广泛 的寄主范围，所以是日本对虾，海参和各种鱼类等海水养殖动物的重要病原弧 菌。在中国(包括台湾)、泰国、印度、澳大利亚等国家和地区，均有由哈哈维 氏弧菌引起水产养殖动物病害流行的报道，造成了水产养殖巨大的经济损失。 抗生素在养殖病害的防治方面发挥了积极的作用，但是滥用抗生素造成的 药物残留和细菌耐药性等不良后果，限制了其广泛应用。所以人们转向利用基 因工程的方法研究包括DNA疫苗，活载体疫苗，基因工程亚单位疫苗等多种类 型的新型疫苗，这些疫苗安全高效的优势，在鱼类病害防治方面具有很好的应 用前景。 在正常代谢中细胞可以产生内源性的活性氧，而且在应答极端温度、紫外 照射、强光、高渗、毒素等环境压力也会加速它的产生。当ROS的产生和ROS 清除之间的平衡机制破坏，就会出现氧化应激并导致机体损伤。超氧化物歧化 酶(Superoxide 为一种重要抗氧化酶，是生物体防御氧毒性的第一道防线。超氧化物歧化酶(SOD) 广泛存在于各种生物体内，根据所含金属离子的不同，可以分为Cu，Zn．SOD、 Mn．SOD，Fe．SOD。 本文通过同源引物从哈维氏弧菌SF．1基因组扩增得到了sod基因，将sod 基因克隆至pMD．19T载体测序，并进行序列的生物信息学分析。sod基因全长 600bp，含有完整的基因开放阅读框，编码199个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸 序列经过Blast比对，表明溶藻胶弧菌(Vibrio 弧菌(Vibriocholerae)V52、梅氏弧菌(Vibrio (Fibrio mimicus)VM603等Fe．SOD的序列相似性分别为91．95％。 将sod基因克隆于pET-26(+)表达载体，构建的阳性质粒在受体菌大肠杆菌 mmol／L BL2l中进行表达，用l IPTG于25℃诱导6h后，SOD得到了很好的表 达。利用表达的融合蛋白N末端的6个组氨酸的多肽标签，通过镍亲和层析完成 了SOD的分离纯化。SDS．PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，纯化的蛋白为单 kDa。 一条带，分子量约为27 采用邻苯三酚自氧化法对SOD酶活分析。酶的最适温度为20℃，最适pH 为7，是一种对热敏感的低温酶，在10．30℃的温度范围内酶活力稳定，温度 超过40℃时酶的活力明显丧失，60℃处理1 6-8 h后酶活力剩余为3％。酶在pH 时稳定。对纯化的SOD含有的金属离子类型进行鉴定：纯化的蛋白最大吸收 峰位于280nm和362 nm，具有典型的Fe．SOD吸收光谱；对氯仿．乙醇和H202 敏感，表明该属于Fe．SOD。 纯化的重组SOD蛋白，通过肌肉注射的方式免疫大菱鲆，4周后用致病性哈 维氏弧菌SF．1进行人工感染试验，对大菱鲆的免疫保护率为80．oo％，而对照组 的死亡率是100％，表明具有免疫保护效应。Westernblot分析中纯化蛋白与大菱 鲆血清发生反应，在相应位置出现了特异性免疫反应条带，说明免疫大菱鲆的 血清中可以检测到的特异抗体。 关键词：哈维氏弧菌；超氧化物歧化酶；纯化；性质；免疫原性 i onandl i veAnaI i Sof Express mmunoprotectys i deDi smutasesmutasefromVibrioliar ／onon St．aerox Harv,yi Abstract Vibrio isa rodbacteriuminmarineandestuarine harveyigram—negative，motile hasbeen as o