共表达猪细小病毒VP2和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位重组乳酸杆菌构建及免疫学初步评价.pdfVIP

摘 要 摘 要 以干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393 （L.casei 393 ）作为递呈抗原口服疫苗活菌 载体，将猪细小病毒保护性抗原 VP2 蛋白的基因片段与大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位 （LTB ）作为目的基因，构建了共表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2 蛋白与 LTB 的 重组干酪乳杆菌表达系统，经过动物免疫试验，分析比较了共表达 VP2-LTB 重组干酪乳杆 菌与单独表达 VP2 重组干酪乳杆菌系统免疫效果及细胞表面表达与分泌表达两种不同表达 方式的免疫效果。 根据目的基因和融合表达载体质粒的特点，应用 Primer Premier 5.0 软件进行设计引物。 以pMD18-T-VP2 质粒和 pMD18-T-LTB 质粒作为模板，通过 PCR 扩增分别得到大约 1750bp 的VP2 基因和约 375bp 的LTB 基因，PCR 产物经酶切后，胶回收连接，并以连接产物为模 板，以 VP2 的上游引物和LTB 的下游引物扩增VP2-LTB ，经PCR 扩增出约 2.1kb 的目的基 因VP2-LTB ，将该基因片段克隆到pMD18-T simple 载体，并进行了酶切、PCR 鉴定和序列 测定，重组质粒命名为 pMD18-T-VP2-LTB 。重组质粒经BamHI 和Xho I 双酶切，回收目的 基因片段 VP2-LTB ，分别与经同样双酶切的表达载体pPG-1 和 pPG-2 连接，电转化感受态 L.casei 393 ，筛选阳性克隆，并进行酶切、PCR 和测序鉴定，重组质粒命名为 pPG-1-VP2-LTB 和 pPG-2-VP2-LTB ，重组干酪乳杆菌命名为pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 和 pPG-2-VP2–LTB /L.casei 393 。 构建的两种重组菌 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 和 pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 在 MRS 培养液中进行培养，以 2%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。重组菌目的蛋白的表达 和定位通过 SDS、Western blot 和免疫荧光及免疫胶体金电镜鉴定。细胞表面表达型 重组干酪乳杆菌经诱导后的 SDS检测结果表明，有约 80kD 的融合蛋白得到了表达， 表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot 结果分析表明，表达的蛋白可被鼠源 PPV 抗血 清所识别，间接免疫荧光及免疫胶体金电镜实验结果表明，所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌 菌体表面检测到；分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后，对诱导表达的菌体及培养上清液进 行 SDS检测表明，有约 75kD 蛋白得到了表达，表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot 结果分析所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性，实验表明，重组的目的 蛋白获得了分泌表达。 为检验构建的重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答以及 LTB 作为粘膜免疫佐剂的作 用，本实验以 BALB/c 小鼠为试验动物，进行免疫学实验。将 BALB/c 小鼠分为五组，每组 9 10 只，通过口服途径分别免疫接种 10 活菌量 pPG-1/L.casei 393 、pPG-1-VP2/L.casei 393 、 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 、pPG-2-VP2/L.casei 393 、pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 ，每隔2w 免疫一次，共免疫四次，每次连续免疫 3d，一天免疫一次。于免疫前、初次免疫后第 7d、 21d 、35d、49d 采集免疫小鼠血液；免疫前、初次免疫后第 1d、5d、12d、19d、26d 、33d、 40d 、47d 和 54d 采集免疫口服免疫组小鼠收集粪便；眼洗液和外生殖道洗液是在免疫前、 初次免疫后第 7d、21d 、35d、49d 分别以 100μl 的PBS 冲洗眼结膜和冲洗外生殖道获得。 所有收集的样品保存于–20 ℃备用。最后测定了小鼠粪便及眼洗液和外生殖道洗液样品中抗 PPV VP2 分泌型 IgA 及小鼠血清样本中抗 PPV 的特异性IgG 水平。 通过 ELISA 方法来检测黏膜样品中特异性分泌型 IgA 抗体的水平，来评价黏膜免疫反 应情况，在粪