食源性病原菌分子分型与寡核苷酸膜阵列检测技术及研究.pdf

食源性病原菌分子分型及其寡核苷酸膜阵 列检测技术的研究 专业：病原生物学 博士研究生：胡玉山 导师：陈晓光教授 南方医科大学公共卫生与热带医学院 中文摘要 背景 食源性疾病是由于食用或饮用了被致病因素污染的食物或饮料引起的疾 病。常见的致病冈素有病原微生物、天然毒素、寄生虫和有毒有害化学物质等。 虽然毒素、有毒有害化学物质等是食源性疾病的重要原因，但是病原菌才是引 起食源性感染疾病发生的主要因素。 由于全球化进程的加快，全球贸易和人员来往日益频繁，食源性感染已成 为当前一项重要的公共卫生问题。无论发展中国家还是发达国家，每年都有很 多爆发病例。流行病学监测数据表明食源性感染疾病的发病率持续上升，同时 引起食源性感染的病原菌也逐渐表现出多样化。除肠道病原菌外，近年来许多 致病力很弱的菌株也成为食源性感染的病原菌。但许多公共卫生部门并未充分 认识到食品安全的重要性，食源性感染疾病的预防控制仍面临着巨大挑战。 食源性感染病原菌的特征主要表现在菌株生物学特性的改变，如革兰染色、 菌落形态、血清学特性的变化等，但这些生物学特性改变往往使常规鉴定方法 有时难以准确的对病原菌进行分类鉴定。食源性感染的另一特点是发病人数往 往较多、发病较快，如果疫情没有及时处理，会有进一步蔓延的可能性。 如何对食源性感染病原菌进行溯源以及快速鉴定是控制食源性感染的关 键。随着对细菌感染研究的日益深入，传统的细菌鉴定技术已不能很好地满足细 菌感染的诊断和流行病学溯源的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去鉴别 细菌变得愈来愈重要，近年来随着分子生物学理论和技术的发展，使得细菌鏊 中文摘要 定、耐药基因的检测、分子流行病学溯源变得更加准确、简洁和快速。多位点 序列分型(Multilocus sequencetyping，MLST)通过直接测定菌株的几个看守基因 的序列，与标准克隆株的等位基因图谱比较，从而确定细菌的型别。其优点在于 可直接对标本的基因片段进行扩增，无需培养病原菌，结果明确，易于标准化，不 同实验室之间的结果可以互相比较。目前在万维网上已经建立了脑膜炎奈瑟菌、 肺炎链球菌、幽门螺杆菌等细菌的MLST全球数据库。脉冲场凝胶电泳(Pulse —field gel kb的DNA片断，最大分辨率可 对细菌的整个基因组进行分析，能够分辨20～500 达5000kb，具有重复性好、分辨率高和容易标准化等特点，可用于实验室室间 比较。基因芯片技术(microarray)是一种反向固相杂交技术，它将大量探针分 子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进 而判断样品中靶分子的数量。由于用该技术可以将大量的探针同时固定于支持 物上，因而基因芯片技术具有高通量、并行处理、微型化和易于自动化等优点。 目前，基因芯片技术在医学、分子生物学领域应用已经越来越广泛，它可实现 大量序列的平行鉴定，迅速敏感地检测基因表达。基因芯片技术在病原微生物 研究中已得到广泛应用，但是往往需要昂贵的点样仪和扫描仪，给该技术的广 泛应用带来了不便。本项研究的目的是建立新的寡核苷酸膜阵列技术，它不需 要昂贵的检测设备，同时保持检测的敏感度和特异性。 选择同一基因片段可同时进行多种致病菌的鉴别。该基因必须是所有病原 菌共有的基因片段，有一定的保守性，其序列的变异性又适合进行属种的鉴定。 rRNA、23S 因此，病原微生物的保守基因常用作鉴别诊断的靶基因，如16S rRNA、16．23S rRNA间隔区等是相对保守的基因。其中，16-23SrRNA间隔区 虽种属间变异较大，但片段较短；23SrRNA在细菌间的变异性较大，但序列不 全，数据库资料不完整；16SrRNA基因在种属内保守性较强，并且序列齐全， 常用于细菌的种系分类。热休克蛋白60是一种高度保守的蛋白质，其编码基因