15 体内药物分析2.ppt

体内药物分析 体内药物分析基本概念 生物样品的种类与采集 生物样品分析的前处理 体内药物分析方法验证 体内药物分析应用示例 生物样品前处理方法 常用的生物样品预处理方法 沉淀蛋白 液液萃取 固相萃取 …… 生物样品分析的前处理 沉淀蛋白 操作： 50μl血浆＋150 μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心10min→取上清液进样分析 常用沉淀剂： 与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈 酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸 …… 生物样品分析的前处理 液液萃取 操作： 血浆＋一定体积萃取溶剂→振荡/涡旋萃取3～5min→3500 rpm离心10min→取上清液氮气下吹干→流动相复溶后进样分析 溶剂的选择与纯度的要求 有机溶剂相和水相的体积 水相的pH 值 常用的液液萃取溶剂： 正己烷 叔丁基甲醚 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇* 相似相容原理进行选用 沸点低、易于挥散和浓集 不易乳化、不影响紫外检测 体积选择依据实验考察 水相的pH值 水相pH值主要由药物的pKa确定 碱性药物最佳pH值要高于pKa值1～2个pH单位 酸性药物则要低1～2个pH单位 碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取 液液萃取的优点： 选择性高 便于纯化和富集 操作方便 对仪器的污染小 缺点： 易产生乳化 操作费时，不易于自动化 生物样品分析的前处理 固相萃取 ——规模缩小的柱色谱 将具有吸附、分配或离子交换性质的担体作为萃取剂填入小柱，溶剂淋洗活化后，将生物样品通过小柱，使其药物或杂质保留在担体上，选择一种溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。 常用担体：疏水性的C18化学键合硅胶等 固相萃取操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者浓缩后进样 SPE操作过程 采用离心或者抽真空的办法，以一定离心力或者流速，进行上样、淋洗和洗脱 固相萃取的优点： 无乳化现象 使用溶剂安全价格低廉 萃取效率高 处理速度快，具有一定通量 较易自动化或联用 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性强的Ⅱ相代谢产物 示例 不同生物样品中虎杖苷前处理方法 A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷 Mr390 B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷 Mr406 SD大鼠血浆样品：乙腈沉淀蛋白；操作简便快速，适用于大量样品；色谱柱污染和不可逆堵塞 组织和排泄样品：0.5mol/L磷酸二氢钠酸化样品后，乙酸乙酯∶正丁醇＝5∶1进行液液萃取；PD较大的亲水性，常规溶剂萃取效率很低，故选择混合溶剂来提取；富集使得灵敏度提高；吹干时间长 Shouhong Gao, Guorong Fan, Zhanying Hong, et al. J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245. 犬血浆样品：固相萃取 0.5mol/L磷酸二氢钠酸化样品后，上柱，20％甲醇淋洗后用100％甲醇洗脱，吹干后流动相溶解进样；同时可以获得II相代谢产物的富集；易于自动化 色谱柱：DiamonsilTM C18（5?m ，200×4.6mm） 分析柱前备有Supelco保护柱 流动相：甲醇-水（35∶65） 流 速：1.0ml/min 紫外检测波长：290nm(0.0005aufs) 柱 温：25±1℃ 蛋白沉淀（SD大鼠血浆） 固相萃取（犬血浆） 液液萃取（肾组织） 液液萃取（尿液） LC/MS/MS 液相色谱强大的分离能力和质谱高灵敏度、高选择性的特点 MS扫描模式强大 Full scan SIM SRM MRM…… 已经成为生物医药分析领域重要的检测技术 Varian 1200L LC/MS/MS 干燥气去簇 ESI示意图 液质联用对样品前处理的要求 基质效应的存在 基质效应可认为是样品中分析物周围所有成分的集体干扰行为。 除分析物外样品中所有其它成分所引起的分析误差，尤指来自生物样品中未知的或性质不确定的成分或体系特性(如粘密度、离子强度、表面张力等)所引起的干扰。 基质效应的程度在不同动物、不同个体来源的样品之间和在同种基质处于不同时期样品之间都会呈现一定的差别。 不同样品前处理技术对基质效应的影响 采用柱后灌注法研究 液质联用对样品前处理的要求 选择合适的样品预处理条件合适的蛋白沉淀剂合适的固相萃取柱合适的萃取溶剂 不同QC浓度下，对目标化合