2010版-高效液相色谱法.ppt

2010年版《中国药典》高效液相色谱法修订内容 河南省食品药品检验所 2010,10 常见的分离方式 蒸馏 离心 电泳 过滤 超滤 色谱 色谱法的分离原理是： 溶于流动相(mobile phase)中的各组分，经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，那么在固定相中滞留的时间就不同，故从固定相中流出的先后也就不同。 这种方法被称为色层法、层析法。 色谱分离的机理 分离是一个物理的过程。 色谱法在2010年版药典二部的应用 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱 什么是液相色谱？ 2010年版《中国药典》 对流动相的要求 反相色谱系统的流动相： 首选甲醇－水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。 应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。 由于C18 链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18 链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 2010年版《中国药典》 对流动相的要求 试验中，如需调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改变量不超过±30%，且相对于总量的改变量不超过±10%为限 如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。 流动相的pH 值：应控制在2～8 之间。当pH 值大于8 时，可使载体硅胶溶解；当pH 值小于2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。 PH的影响传统硅胶基质填料的pH局限性 2010年版《中国药典》 对流动相的要求 当色谱系统中需使用pH 值大于8 的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等； 当需使用pH 值小于2 的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机-无机杂化填充剂等。 2010年版《中国药典》  对色谱柱的要求 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。 反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂； 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂； 对映异构体的分离通常使用手性填充剂。 2010年版《中国药典》  对色谱柱的要求 填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。 孔径在15nm（1nm=10?）以下的填料适合于分析分子量小于2000 的化合物， 分子量大于2000 的化合物，则应选择孔径在30nm 以上的填料。 2010年版《中国药典》  对色谱柱的要求 除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3μm~10μm 之间。 粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm），使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。 当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。 2010年版《中国药典》 对色谱柱的要求 1、色谱柱 （1）常用色谱柱填料粒径3～10μm （2）微径柱填料粒径 约2μm（UPLC或UFLC） 硬件须匹配 色谱条件可适当调整 以品种正文规定条件的测定结果为准 2、柱温 （1）通常为室温（通常不超过40℃） （2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过 60℃ （a）提高灵敏度，峰高的对数与柱温呈线性关系 （b）为改善选择性（改善分离效果） 2010版药典二部中色谱柱的使用情况 色谱柱的应用：高效液相色谱 色谱柱的应用：高效液相色谱 Inersil（ ODS-2，5μm，4.6mm×250mm）柱色谱图