急性白血病死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因表达及其启动子区甲基化状态的研究.pdf

一、摘要 中文论著摘要 英文论著摘要 二、英文缩略语·· 三、论文 —1．￡·．jL一 日¨舌………… 材料与方法… 实验结果…… 讨论………… 结论………… 四、本研究创新性 五、参考文献…… 六、附录 综述………… 致谢………… 个人简介…… ·中文论著摘要· 急性白血病死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因表达及启 动子区甲基化状态研究 目的 通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株进行的DNA甲基化及基因表达的实 验研究，力求探讨DAPK基因甲基化在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲 基化的状态，并分析两者之间的相关程度，为DAPK基因在急性白血病中的生物学 功能的进一步研究奠定基础，为急性白血病的临床诊疗新思路提供理论依据。 实验方法 1、标本的选取 标本选取急性白血病初发或治疗后复发确诊患者119例，其中男性51例，女 病17例。所有患者均参照《血液病诊断及疗效标准》第三版进行诊断，按照法英 美协作组诊断标准(FAB标准)进行分组。选取血象正常非白血病患者为正常对 照。 2、细胞的提取 肝素抗凝骨髓经淋巴细胞Ficoll—ttypaque液分离单个核细胞，用于下一步实 验。 3、RNA提取及RT-PCR检测DAPKmRNA表达 心管中，加入lmlTrizol液，充分混匀，室温放置5分钟。加入氯仿0．2ml，震 1 荡混匀15秒，室温放置3分钟，4。C1000rpm离心15分钟。缓慢吸取上层水相， 加入到新1．5ml塑料离心管中，再向该新管中加入0．5ml异丙醇，混匀，室温放 置lO分钟。4。C 洗涤管盖、管壁及管底沉淀。4。C7500rpm离心10分钟，缓慢充分弃去上清，用 微量吸头吸取管中残留液体，室温干燥10分钟。加入经DEPC处理高压消毒的双 蒸水6-15ul，充分溶解RNA沉淀。所提取的总RNA溶解后用紫外分光光度仪检 浓度换算成单位为pg／p1．RNA终浓度稀释为3ug／II1。cDNA第一链合成体系为 25 p dT以及相关试剂按说明配成适当浓度，合成 l，用逆转录酶M-MLV，Oligo cDNA。 反转录成cDNA后运用RT-PCR法检测基因在白血病细胞及正常细胞中表达情 DNA酶、引物和适当双蒸水，以 况。实验试剂包括lOXPCR缓冲液、dNTP、Taq 内参照作为阳性对照，以去离子水替代DNA模本作为阴性对照。反应条件为95C 扩增28个循环，72。C延伸5min。扩增后将扩增产物在159／L琼脂糖凝胶仪上进 行电泳l小时，GeneFinder染料染色，成像仪观察并摄像。 4、DNA提取与修饰及巢式甲基化检测DAPK甲基化 酚一氯仿法提取DNA，按文献方法进行DNA预处理保存。运用亚硫酸氢盐法对 DNA纯化试剂盒对DNA进行纯化，方 基因组DNA进行修饰，用Wizard@Genomic 法按说明书操作。修饰所得产物即为模板进行MSP或一20。C保存。用巢式甲基化特 异性PCR(n-MSP)法对急性白血病患者DAPK基因启动子甲基化状况进行检测。 第一轮反应条件为95℃预变性5min，然后95℃延伸30S，退火温度为55℃30S， u 稀释取2 L作为第二轮扩增的模板，其他体系成分同第一次PCR。第二轮反应条 摄像。观察电泳结果，获得甲基化产物即可判定为甲基化阳性：得到非甲基化产物， 且无甲基化产物判定该例标本为非甲基化：既未获得甲基化产物也未获得非甲基 化产物则标志本次实验失败。 5、T载体克隆测序