人骨髓间充质干细胞和退变髓核细胞体外共培养的实验的研究.pdf

人骨髓问充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究 中文摘要 人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的 实验研究 中文摘要 第一部分人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养 【摘要】目的：探讨人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养方法。 方法：收 酶II消化分离出髓核细胞并连续培养传代，倒置相差显微镜观察细胞形态学变化， 免疫细胞化学法行II型胶原染色，甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表 达，观察髓核细胞的类软骨表型的表达。结果：采用0．025％的II型胶原酶加0．004％ 的脱氧核糖核酸酶II4C过夜消化可较好的分离培养出人退变椎间盘髓核细胞；原代 髓核细胞平均7天贴壁，细胞呈类圆形或多角形，细胞95％融合所需时间约4周；聚 集蛋白聚糖和II型胶原表达于分离培养的髓核细胞，被甲苯胺蓝染成天蓝色，II型胶 原染色为黄褐色。 结论：采用0．025％的II型胶原酶加0．004％的脱氧核糖核酸酶II 消化法体外成功培养出髓核细胞：髓核细胞呈类软骨表型，合成分泌聚集蛋白聚糖及 II型胶原蛋白。 【关键词】椎间盘退行性变；髓核细胞；细胞培养；甲苯胺蓝；免疫细胞化学 第二部分人骨髓间充质千细胞的体外分离培养、鉴定及其诱导分化 【摘要】目的：体外分离培养、鉴定人骨髓间充质干细胞，并检测其多向分化潜 能。 方法：取正常成人骨髓，应用密度梯度离心法与贴壁培养法分离、纯化人骨髓 间充质干细胞并在体外进行培养，倒置显微镜观察细胞形态特征；流式细胞仪检测细 胞表面抗原，并利用成骨诱导剂、成脂诱导剂、成软骨诱导剂诱导人骨髓间充质干细 Kossa染色、油红O染色、 胞向成骨、成脂、成软骨方向分化，碱性磷酸酶染色、Von Safranin’O．Fast Green染色、阿利新蓝染色、II型胶原免疫组织化学法检测其定向分 中文摘要 人骨髓问充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究 化。 结果：培养的细胞呈长梭形外观；流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、j 天后，碱性磷酸酶染色、VonKossa染色、油红O染色、Safranin’O．FastGreen染色、 阿利新蓝染色、II型胶原染色阳性。结论：通过密度梯度离心法与贴壁培养法可大 量扩增、纯化人骨髓问充质干细胞，骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。 【关键词】间充质干细胞；骨髓；诱导分化；细胞培养 第三部分人骨髓间充质于细胞与退变髓核细胞体外共培养下的相互影响 【摘要】目的：研究体外人退变髓核细胞(nucleuscells，NPCs)与骨髓 pulposus marrow．derived stem 间充质干细胞(Bone mesenchymalcells，BMMSCs)共培养时， BMMSCs及NPCs的形态学变化。 结果：从第4天起，共培养组上清液中TGF—Dl、 单独培养组、NPCs单独培养组明显增多(PO．05)。从第4天开始的各个时间点，共 并且II型胶原在第12天的表达也显著高于单独培养组(Po．05)；同时从第8天起至 明显变化。 结论：骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养时，骨髓间充质干细胞在髓 核细胞营造的微环境下向类髓核细胞转化；骨髓问充质干细胞可通过分泌TGF．pl、 IGF、PDGF等细胞因子发挥其营养效应，激活髓核细胞，促进其增殖及细胞外基质 II 人骨髓问充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究 中文摘要 的合成。 【关键词】 椎间盘退行性变；间充质干细胞；骨髓；髓核细胞：共培养 第四部分TGF．pl对不同程度退变椎问盘的髓核细胞生物活性的影响 【摘要】目的：采用外源性转化生长因子pI(TOF·61)模拟骨髓间充质干细胞的