CXCR4基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定.pdfVIP

局解手术学杂志　 2015 年 第24 卷　 第5 期　 　 J REG ANAT OPER SURG,2015,Vol.24,No.5 ·473 · ·论　 　 著 · CXCR4 基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定 1 2 1 3 4 1 徐丽娟 ,王淑芳 ,张云巍 ,潘美妍 ,胡亚卓 ,阎　 丽 　 (1.解放军总医院南楼临床部消化内科,北京 100853;2.解放军总 医院输血科,北京 100853;3.解放军济南军区第二疗养院,山东 济南 250000;4.解放军总医院老年医学研究所病理科,北京 100853) 　 　 [摘　 要]　 目的　 构建CXCR4基因慢病毒过表达载体并对其进行包装、鉴定。 方法　 首先设计合成引物,采用PCR法扩增 目的基因CXCR4,将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,成功构建重组载体慢病毒表达载体pGC-FU-CXCR4,将其产物转 化大肠杆菌感受态细胞。 对培养出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,最后将获得的病 毒载体共同转染293T细胞,收集病毒颗粒,并采用Real time PCR法测定病毒滴度。 结果　 PCR鉴定结果显示扩增的目的基因已 成功插入pGC-FU载体,Western Blot结果显示得到的片段与理论大小相符,阳性克隆测序结果与目的基因序列一致,说明重组慢病 毒载体的插入序列完全正确。 结论　 本实验成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,并成功对慢病毒进行了包装及病毒滴度测定。 　 　 [关键词]慢病毒载体;CXCR4基因;293T 细胞 　 　 [中图分类号] Q344+.13　 [文献标识码]A　 [文章编号] 1672-5042(2015)05-0473-04 Construction,package and identification of lentiviral vector for CXCR4 gene 1 2 1 3 4 1 XU Li-juan ,WANG Shu-fang ,ZHANG Yun-wei ,PAN Mei-yan ,HU Ya-zhuo ,YAN Li 　 (1.Department of Gastroenter- ology,Instituteof Geriatrics,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China;2.BloodTransfusion Department,General Hospital of PLA,Bei- jing 100853,China;3.SecondSanatorium,JinanMilitary Region,JinanShandong250000,China;4.Departmentof Pathology,Instituteof Geri- atrics,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China) 　 　 Abstract:Objective　 To construct and identify lentiviral vector pGC-FU-CXCR4 gene. Methods　 CXCR4 gene amplification was used by real-time polymerase chain reaction.The target gene fragments with the digested plasmids were exchange.Then the lentiviral vector pGC-FU-CXCR4 was constructed successfully.Use the constructed lentiviral vector to infect the competent escherichia coli cells.Polymerase chainreactionanalysiswasusedtoidentifytheculturalclonesandDNAsequencingandcompar