检测肠道病毒71型RT-LAMP技术建立和应用效果检验.pdf

目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………··1 英文论著摘要……………………………………………………………………··6 二、英文缩略语………………………………………………………………………·11 三、论文 前言…………………………………………………………………………………………………………12和舌…………………………………………………………………………………………………………12 材料与方法…………………………………………………………………………13 实验结果…………………………………………………………………………·20 讨论…………………………………………………………………………………………………………27 结论…………………………………………………………………………………………………………31 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………32 五、参考文献…………………………………………………………………………33 六、附录 综述…………………………………………………………………………………………………………36 在学期间科研成绩………………………………………………………………·46 致谢…………………………………………………………………………………………………………47 个人简介…………………………………………………………………………48 ·中文论著摘要· 检测肠道病毒71型的RT．LAMP技术的建立 及其应用效果检验 刖 肓 肠道病毒7l型(Enterovirus 球范围内引起十多次大的爆发流行，感染蔓延到全世界，尤其是近年来在亚太地 区的发病率呈上升趋势。国内1981年在上海首先发现，迄今北京、河北、天津、 福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东、厦门、辽宁、武汉、香港等二十几个省 市均有报道。 EV71对脊髓前角细胞具有特殊的组织嗜性，是引起急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis，AFP)的非脊灰肠道病毒(Non—polio andmouth 的病原体。近年来的流行病学资料显示，EV71与手足口病(Hand，foot disease，HFMD)的暴发流行关系密切，并可导致无菌性脑脊髓膜炎、脑炎、心肌 炎和脑麻痹后遗症等严重并发症，甚至导致死亡。国外报道EV71感染并发严重疾 病的发生率o．3％，国内则有高达1．69％的报道。早期诊断和治疗对于防止并发症 的发生及患者的预后关系重大。因此，快速、特异、简捷的病毒感染检测方法成 为临床上的迫切需要并受到高度重视。 isotherm 环介导等温扩增技术(100p．mediated 等2000年建立的一种新的核酸扩增方法。其原理是利用一种链置换DNA聚合酶 (BstDNApolymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等 温条件下(65C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩 GreenI、溴化乙啶 增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，也可以由添加SYBR (EB)或其它核酸染剂进行呈色后观察。其优点是特异性强，扩增效率高，反应灵 敏，操作简单。因而被国内外学者应用到多种细菌及病毒的基因检测中。目前尚 列设计3对特异引物，建立并优化了检测该靶序列的RT．LAMP扩增体系，同时对 其特异性和敏感性进行了验证。应用该技术对辽宁省临床诊断HFMD患者标本进 (Real．time PCR)方法进行了比较分析。旨在为临床EV71感染诊断寻求快速、简 便、可行的新方法。 方法 一、引物设计与合成 日本荣研公司LAMPPrimer 4引物设计软件在序列的保守区域筛选出6 Explorer 条引物