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中文摘要
中文摘要
间充质干细胞调节破骨细胞发育与功能的研究
研究背景和目的
破骨细胞是一类起源于造血干细胞的成体细胞,它们大部分贴附于骨表面,
可以分泌多种酸和溶解酶来降解骨组织。在机体代谢稳定时,只有少量的破骨细
胞生成,与成骨细胞相协调,参加骨重塑。近来,研究人员发现破骨细胞还参与
机体防御与修复,炎性疾病以及肿瘤的骨转移。破骨细胞的发育很大程度上受到
其所在的细胞微环境的影响,其周围的细胞分泌多种重要细胞因子,表达细胞表
面分子来调节破骨细胞的生成。
stem
间充质干细胞(mesenchymalcells,MSCs)最早在骨髓中被发现,适宜的
条件下能分化为多种细胞。MSCs及其分化的细胞是骨髓微环境中的主要支持细
胞。MSCs借助细胞因子和/或细胞间直接接触,调节大多数造血细胞的存活、增
殖和分化。
虽然MSCs和破骨细胞都位于骨髓微环境中,然而,有关MSCs和破骨细胞
之间联系的研究却不多。本研究借助于一种可靠高效的小鼠MSCs分离培养方
necmsis
法,着重研究了MSCs受到肿瘤坏死因子伍(tumorfacto卜a,TNF.a)刺激
后,对破骨细胞的抑制作用及其机制。并借助类风湿关节炎病人的关节腔液
anhritis fluid,RASF)和脂多糖注射小鼠模型,探究了MSCs
(rheumatoidsynovial
在体外和体内复杂炎性微环境中对破骨细胞的调节作用。同时,初步研究了RASF
来源的MSCs对破骨细胞的调节作用。
研究方法
l、采用骨实质分离培养法获得小鼠MSCs,对其进行三系诱导分化鉴定。以流
式分析其免疫表型。
2、分离小鼠cDllb+单核细胞,将其与MsCs共培养,部分培养组内再添加巨噬
factorM-CSF)和核因子1cB
细胞集落刺激因子(macrophagecolony·stimulating
activatorofNF.1cB
的受体激活子配体(receptor ligand’RANKL),观察MSCs
对于单核细胞来源的破骨细胞分化、成熟、存活和骨吸收能力的影响。
3、以TNF.a预处理MSCs,然后再用于和单核细胞共同培养。有些实验组中,
直接添加TNF.a到MSC和单核细胞的共培养体系中去。上述实验组同样应
用于象牙片共培养试验,检测破骨细胞的骨吸收能力。接下来,采用transwell
V
中文摘要
培养法把MSCs和单核细胞共同培养但是避免直接接触,再进一步采用
RT-PCR,real.time
PCR和ELISA来分析MSCs中破骨细胞生成抑制因子.骨
OPG在mRNA和分泌蛋白水平的变化。分析TNF.值刺激后,MSCs中破骨
mRNA表达情况。
ERK/MAPK和刷刈SAPK通路有无发生活化。采用这三条通路相应的通路抑
PCR检测MSCs
制剂来预处理MsCs,再给予TNF吨刺激,然后以reaJ-time
中oPG的mRNA水平。同时,采用通路抑制剂来预处理MSCs。再给予TNF.Q
刺激,然后以单核细胞共同培养,观察MAPK通路活化对于破骨细胞生成的
影响。
5、分别对n吓.仅刺激后的MSCs免疫学表型和多向分化能力做检测。同时,采
用CFSE标记法,观察TNF.a刺激过的MSCs能否抑制conA引起的CD3+T
淋巴细胞增殖。
样本刺激Mscs,再把MScs和单核细胞共同培养,观察破骨细胞生成的情
况。
7、经静脉给脂多糖小鼠注射MSCs,取小鼠股骨做病理切片,做原位抗酒石酸
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