天敌对稻飞虱捕食作用的评价方法的研究___多重实时荧光定量PCR方法研究和初步应用.pdf

中文摘要 褐飞虱Nilaparvatalugens、灰飞虱Laodelphax 虫；稻田生态系统中，捕食性天敌的种类和数量非常丰富，在控制稻飞虱为害方 面起着重要的作用；明确捕食性天敌种类以及各种捕食性天敌对稻飞虱控制作用 的大小是充分发挥天敌控制作用的基础和前题。本研究通过PCR克隆得到白背 飞虱、褐飞虱和灰飞虱的ITS基因序列，设计合成了三种飞虱的引物和特异性 ALLGlo探针，建立优化了ALLGlo探针三重实时荧光定量检测体系和方法，并 应用该方法对稻田常见捕食性天敌对稻飞虱的捕食作用进行了研究。获得的主要 结果如下： 1．利用PCR方法克隆了白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的线粒体细胞色素氧化 1％． 间的相似性分别为89．02％，67．98％和70．1 2．利用白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的ITS2基因序列，设计合成了一对这三 种飞虱特有的引物，该引物不与稻田其它主要害虫，天敌和中性昆虫基因组DNA 发生扩增作用，具有这三种稻飞虱的特异性；该引物对白背飞虱、褐飞虱和灰飞 虱基因组DNA的扩增片段长度分别为192，21 5和207bp；利用该引物建立了多 重PCR体系，该体系可定性检测捕食性天敌消化道内残留的飞虱基因组DNA。 3．根据ALLGIo探针设计原则，选取白背飞虱，褐飞虱和灰飞虱的ITS2基因 序列，利用Primer 2．0软件，设计合成了白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱引物 Express 和特异性ALLGIo探el；通过调整引物、探针、dNTP和酶浓度，建立优化了三重 实时荧光定量检测体系。该体系仅与这三种稻飞虱发生反应，具有高度的特异性， 该三重实时荧光检测体系对白背飞虱标准质粒的灵敏度为100个拷贝，标准曲线 107；褐 飞虱标准质粒的灵敏度为1 87．98％，动态范围 贝，标准曲线为y=．3．64819x+42．898，R2=O．99，扩增效率为1 为102一lO7。干扰实验证明，将不同模板按不同浓度组合，当两种飞虱模板浓度 即使相差10000倍时，低浓度的质粒DNA仍然能够检测到，并且具有很高的相关 性，决定系数R2达到0．99以上；同时，捕食者基因组DNA对猎物DNA的多重实时 定量PCR不存在抑制作用或降低扩增效率。 192839，标 4．定量检测结果表明单头白背飞虱长翅雌虫目标拷贝数为111 准差为8873990，变异系数为7．98％；单头褐飞虱长翅雌虫目标拷贝数为 CTAB裂解法提取基因组DNA过程中目标拷贝的平均损失率为10．66％，因此可 以用CTAB法提取捕食者消化道内残留的微量猎物基因组DNA。单头白背飞虱、 褐飞虱和灰飞虱长翅型雌性成虫在拟环纹豹蛛消化道内的降解曲线分别为：白背 残留约2710个拷贝。 5．应用多重实时荧光定量PCR研究了嘉兴单季晚稻田主要捕食性天敌对白 背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的捕食作用．结果表明，在稻田生态系统中，白背飞虱、 褐飞虱和灰飞虱有多种共同的捕食性天敌，不同捕食者对不同猎物的阳性反应率 不同。就白背飞虱而言，八斑球腹蛛阳性率最高达73．64％，最低的黑肩绿盲蝽也 达到34．94％；对褐飞虱而言，黑肩绿盲蝽阳性率最高达72．06％，最低的为锥腹 肖蛸仅有12．71％；对灰飞虱而言，拟环纹豹蛛阳性率最高达79．14％，最低的为 锥腹肖蛸也达到44．92％。 6．不同捕食者对三种稻飞虱猎物留量存在很大差异。在整个水稻生长期内， 就白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱来说，都是拟环纹豹蛛消化道内猎物平均残留最高， 均残留拷贝数最少，为5214拷贝；对褐飞虱食虫瘤胸蛛平均残留拷贝数最少， 为500151拷贝；对灰飞虱锥腹肖蛸平均残留拷贝数最少，为32957拷贝。 7．对三个不同调查时间的捕食性天敌消化道内飞虱残留种类、构成进行分 析。对于灰飞虱和白背飞虱在7月上前后迁入，褐飞虱在7月下一8月上迁入的 迟栽单季晚稻，分蘖末期(8月14日)时拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛