鼠疫caf1基因克隆与在酵母中表达及研究.pdfVIP

摘要 摘 要 鼠疫(Plague)是由鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)引起的 种烈性人畜共 患传染病。目前WHO每年大约有2000例有关鼠疫的报道。鼠疫菌历来被外军列入 重要生物战剂范畴，也是国际恐怖分子采用的廉价而方便的资源，威胁国家安全和 社会稳定。目前世界上使用的人用鼠疫疫苗主要有减毒活疫苗和灭活全菌体疫苗， 这两种疫苗免疫效果的确定性和接种反应方面存在一些弱点，为此研制一种保护 力更强的新疫苗取代现行疫苗对经济发展、国防和反恐将产生巨大意义。本研究 的目的是通过分子克隆技术，构建可表达 。几蛋白的酵母真核表达系统。 cafl基因的克隆及表达载体的构建。首先设计合适的引物，通过PCR方法从 1351l42EV鼠疫质粒上扩增出caf操纵子片段。测序确定与文献报道的操纵子 序列完全一致，根据cafl目的基因在caf操纵子上所在的位置及相应的载体特异 性酶切位点设计特异性引物，通过PCR方法扩增出含双酶切位点的cafl目的基因。 通过定向克隆方法将cafl目的基因连接到pESC-URA质粒上，并成功转入f.coli DHSa，获得含cafl目的基因的表达载体pESC-URA-cafl 表达载体pESC-URA-cafl电转化导入酿酒酵母INVSc1中并成功表达。将 测序确定正确的酵母表达质粒pESC-URA-can用电转化的方法导入S.cerevisiae INVScI中。在无尿嗜咬的营养缺陷型平板上筛选，经菌落PCR方法证明为阳性 转化子。阳性转化子经质粒稳定性实验证明能稳定传代。 根据宿主菌和重组菌在不同生长时期培养液中的细胞密度绘制它们的生长 曲线图，分析两者生长规律，结果表明两者并无太大差别。选取一株重组菌进行 培养，增菌培养后，分离破碎酵母、提纯蛋白质，经SDS和Westblotting 分析鉴定为cafl抗原。 关键词:鼠疫:“n基因:酿酒酵母;蛋白表达 — ~一-一竺塾墅必主巫兰世笙鱼一— — 一— Abstract Theplagueisanintenseinfectiousbacterialdiseasehavingahigh fatalityratewithouttreatmentandspreadingbetweenhumanandanimal. Thegram-negativecoccobacillusnowdesignatedasYersiniapestishasbeen discoveredasthecausativeagentofplague.Plaguehaskilledanestimated 200millionhumansthroughouthistory.Todaytheplagueisstillendemic inmanycountriesoftheworlds Approximately2,000casesofplagueare reportedeachyeartotheWorldHealthOrganization,andconcernhasbeen raisedaboutthepossibleuseofY.pestisasanagentofbioterrorismand biologicalweapon. Thereisnotenoughevidencetoevaluatetheeffectivenessoflive andkilledplaguevaccines,ortherelativeeffectivenessbetweenvaccines andtheirtolerability.Theobjectiveofthisthesisistoconstructa recombinantengineeringyeaststrainbyintegratingtargetgeneca月 into pESC-URAplamidwithmolecularcloningtechnique. PCRprimersweredesignedtoamplifycafoperonfroma1351/482EV plasmidinvitro,followingaroutinesequencingassaytoidentifyits nu