第五章基因工程研究生9.ppt

科学出版社案例式教材《生物化学》课件 基因工程（genetic engineering）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。 基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。 它的诞生和发展，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。 第一节 基因工程的基本原理 第二节 基因工程的物质基础 一、工具酶 （一）限制性核酸内切酶 （二）DNA聚合酶 (三) DNA连接酶 (四) 其它DNA修饰酶 （一）限制性核酸内切酶 限制酶主要是从原核生物中分离纯化出 来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因 工程操作中所说的限制酶，通常指Ⅱ类限制 性核酸内切酶。 限制酶的性质和作用特点 限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。 切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5′-P、3′- OH的DNA片段。 限制酶切割DNA分子形成黏性末端(sticky end) 和平末端或钝末端(blunt end)两种 。 5′…CTGCA G…3′ PstⅠ识别序列 3′…G ACGTC…5′ 形成3′-OH黏性末端 5′…G AATTC…3′ EcoRⅠ识别序列 3′…CTTAA G…5′ 形成5′-P黏性末端 5′…AG CT …3′ Alu Ⅰ识别序列 3′ …TC GA …5′ 切割后形成平末端 限制性核酸内切酶的用途: ①改造和构建新质粒； ②建立DNA物理图谱； ③基因组DNA同源性研究； ④基因克隆； ⑤DNA分子杂交及序列分析； ⑥制备DNA放射性探针； ⑦DNA甲基化碱基的识别与切割等。 （二） DNA连接酶 DNA连接酶（DNA ligase）是基因工程中所必需的一类酶。它能催化DNA中相邻的5′-磷酸基和3′-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口连接起来，形成完整DNA分子。在基因工程中，最常用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。 表8-1 重组DNA技术中常用的工具酶 酶的名称 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA聚合酶 ①合成双链cDNA的第二条链 ②缺口平移制作高比活探针 ③填补3′末端 逆转录酶 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或 DNA序列分析 DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端 之间形成的磷酸二酯键，使DNA切口封合或 使两个DNA分子或片段连接 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 （一）克隆载体 1. 质粒载体 2. 噬菌体载体 3. 酵母人工染色体载体 （二）表达载体 1. 大肠杆菌表达载体 2. 真核表达载体 基因载体应具备的条件： ①具有自主复制能力； ②有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（MCS） ③具有一个或多个选择性遗传标记 ④分子量小，能容纳较大的外源DNA分子 ⑤具有较高拷贝数，便于分离提纯； ⑥具有较高的遗传稳定性。 （一）克隆载体 1. 质粒 质粒（plasmid）是存在于细菌染色 体之外的、具有自主复制能力的双链环 状DNA分子。 常用的质粒载体有pBR322(图8-3)、 pUC系列及TA克隆载体等多种。 pUC系列载体的优点： ①具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ②适用于组织化学方法检测重组体。 ③pUC载体系列的MCS与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在两类载体系