三种旋毛虫属特异性抗原的鉴定及其53kDa抗原基因的克隆.pdfVIP

2004届 郑州大学硕士研究生论文 三种旋毛虫属特异性抗原的鉴定及53kDa抗原基因的克隆 研究生 卫海燕 导师 王中全崔晶 郑州大学基础医学院寄生虫学教研室(郑卅i450052) 河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052) 摘 要 旋毛虫是分布最广泛的寄生虫之一，可感染人及150多种哺乳动物，引起的旋毛虫 病是一种严重的人兽共患病。旋毛虫病呈世界性分布，被认为是再度肆虐的疾病，若不 及时诊断和治疗，患者的死亡率可达3％一30％。人类主要因生食或半生食猪肉而感染， 故为预防人体旋毛虫病，对猪肉的旋毛虫检疫非常重要，否则，不仅严重危害人体健康， 还对养猪业及肉类出口造成巨大的经济损失。随着我国加入WTO后国际贸易的增多， 每年将有大量动物肉类进出口，猪肉在肉类进出口中占有很大比重，因此，我国亦有可 能出口或从国外进口含有旋毛虫的动物肉类及肉制品，从而影响我国的肉类贸易信誉或 从国外输入旋毛虫病。但目前尚无用于肉类及肉制品中旋毛虫的特异性快速检疫方法。 国内常采用膈肌压片显微镜检查，时有漏捡现象发生，酶联免疫吸附试验(ELISA)在 国内外均已试用于生猪屠宰前的旋毛虫病检疫，但所使用的旋毛虫幼虫可溶性抗原、排 泄分泌(ES)抗原及单抗纯化抗原，或因抗原成份复杂、或虫体来源困难难以大量制各 及抗原制备难以标准化等因素影响了血清学方法检疫旋毛虫的发展和推广应用。随着分 子生物学技术的发展及其在寄生虫学上的广泛应用，基因重组抗原由于可大量制备、特 异性好等优点，有希望用于肉类及肉制品中旋毛虫的检疫。从旋毛虫(T1)、北方旋毛 虫(T2)及南方旋毛虫(T7)中鉴定出旋毛虫属特异性抗原，利用基因工程技术生产出 基因重组抗原，能够解决天然虫体抗原来源的困礁，即可用于多种旋毛虫引起的旋毛虫 病的诊断，又可对肉类及肉制品中的多种旋毛虫进行检疫。因此，本文应用免疫印迹对 Tl、T2、T7的肌幼虫可溶性抗原及ES抗原进行了分析，并对1种属特异性共同抗原 (53kDa)进行了基因克隆和序列分析，为53kDa抗原的表达和应用奠定了基础。 第一部分：三种旋毛虫属特异性抗原的鉴定 材料和方法 制各3种旋毛虫(T1、T2、T7)的可溶性抗原和ES抗原，测定各种抗原的蛋白 2004届 郑州大学硕士研究生论文 浓度，将各种抗原进行SDS．PAGE分析，银染后可看到各种不同的电泳带。然后进行 Western blot分析，鉴定3种旋毛虫的属特异性共同抗原。 结果 kDa。T1旋 kDa。 43、38、35、29、22kDa为主带；T7旋毛虫ES抗原主带为160、58、43、35 3．旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的Westernblot结果：53kDa蛋白组分为 Tl、T2两种旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及Es抗原中的属特异性共同抗原；T1旋毛虫肌 幼虫可溶性抗原中的53 的肌幼虫Es抗原之间及T2与T7的肌幼虫Es抗原之间存在有属特异性共同抗原。 结论 1。53 性共同抗原。 起的旋毛虫病的血清学诊断及肉类中3种旋毛虫检疫的候选抗原。 第二部分：旋毛虫肌幼虫53ld)a抗原基因的克隆及序列分析 材料和方法 。 其编码蛋白的二级结构和B细胞表位及信号肽区域后设计了一对巢式引物，通过 8中，经 RT．PCR扩增出53kDa抗原基因的大部分序列，并将其插入到克隆载体pUCl 重组质粒进行鉴定，结果正确后测序，并通过生物软件对Ts53抗原基因进行