蛋白质工程与食品工业中的应用.pptVIP

蛋白质工程主要包括4大类研究： 第一，利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。第二，定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等. 第三，从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质。 第四，根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体. 第二节 蛋白质工程的基本步骤与改造策略 一、??蛋白质工程的基本步骤 (1)分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。 （2）对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。 （3）通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。? ? (4)围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。? ? (5)对经过改造的蛋白质进行功能性测定. 二、蛋白质的改造 小改-----少数几个氨基酸残基的替换，最广泛 突变位点是关键 中改-----分子剪裁 替换一个肽段或者结构域 第三节 、蛋白质改造方法 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为： 初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入 高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接 从头设计合成新型蛋白质 一、?初级改造?? 通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。? 目前，主要采用的基因突变方法： 基因定位突变 盒式突变。 基因定位突变 根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。 这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 基因定位突变的基本过程： 首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。 （二）随机诱变技术 （三）盒式突变技术 常用方法：将基因克隆到质粒上，旁边有两个紧密相连的限制性内切酶位点，双酶解后产生一个3′凹陷的末端和一个5′凹陷的末端，与克隆基因想邻的末端是3′凹陷和5′凹陷。 1985年Wells提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱和性”分析。 利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。 蛋白质初级结构改造的例子 二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接） 研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域 结构域由α螺旋、β折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。 构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。 三、全新蛋白质的设计与构建 上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。 如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。 第四节 蛋白质工程在食品中的应用 蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。 提高蛋白的稳定性包括以下几个方面： ①延长酶的半衰期； ②提高酶的热稳定性； ③延长药用蛋白的保存期； ④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 一、蛋白水解酶 蛋白水解酶简称蛋白酶 例如：枯草芽孢杆菌 缺点：极易氧化而失活 原因是第222位的甲硫氨酸残基（Met-222）发生了90%的氧化，运用基因定点诱变技术，运用非野生型的氨基酸密码取代Met-222密码子，获取一系列的突变基因，最终获得19种不同的枯草杆菌蛋白酶突变株。 通过检测，Ala-222取代Met-222的突变蛋白酶抗氧化性得到大大的提高，制成的洗涤剂可以和漂白剂一起使用 二、溶菌酶 溶菌酶：天然的防腐剂，催化速率随着温度的升高而升高，因此提高酶的热稳定性能提高其应用价值 由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位