骨髓间充质干细胞BMSCs治疗挤压伤性急性肾损伤衰竭的实验的研究.pdfVIP

骨髓间充质干细胞治疗挤压伤性急性肾损伤(衰竭)的 实验研究 中文摘要 目的： （1）采用密度梯度与贴壁相结合方法，培养符合实验要求的兔骨髓间充质 干细胞(BMSCs), 并对其进行生物学特性鉴定。（2 ）探索合适、稳定的挤压伤性 急性肾损伤(衰竭)制模方法。（3 ）对出现挤压伤性急性肾损伤(衰竭) 的家兔行 BMSCs 静脉移植治疗，观察 BMSCs 对肾脏修复的促进作用。 方法： 一、兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养及鉴定实验 1. 无菌条件下，采取日本大耳白兔股骨及胫骨骨髓，采用密度梯度离心和 贴壁培养筛选法分离纯化骨髓间充质干细胞，放置 37OC、5%CO2 培养 箱中进行原代、传代培养。 2. 采用慢速冻存法保存生长良好的 P3 代 BMSCs ，并对冻存P3 代 BMSCs 进行复苏，观察细胞的生长状况。 3. 选取生长良好的 P1 、P3 、P5 代 BMSCs 按四唑盐(MTT) 比色法测定不同 天数 BMSCs 的光吸收值（OD 值）。以时间为横轴，OD 值为纵轴，绘 制出 BMSCs 生长曲线。 4. 选取生长良好的 P3 代 BMSCs 在成脂培养基中培养，定时换液，观察细 胞形态变化。两周后进行油红 O 染色、拍照。 5. 选取生长良好的 P3 代 BMSCs 在成骨培养基中培养，定时换液，观察细 胞形态变化。三周后行 VonKossa 法染色、拍照。 6. 选取生长良好的 P3 代 BMSCs 加入抗 CD29，CD34，CD90 抗兔抗体， 流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD29、CD34、CD90 的表达。 二、挤压伤性急性肾损伤（衰竭）制模实验 选用日本大耳白兔 58 只，体重 2.7~3.2kg ，随机分成三组。A 组 6 只，给予 27.5kg 重量挤压 5 小时；B 组 10 只，给予 30kg 重量挤压 5 小时；C 组 42 只， 2 分两次挤压，第一次予 30kg 重量挤压 3 小时，24 小时后再予 30kg 重量挤压 3 小时。挤压前及挤压后 7 天检测血肌酐（SCr ）、尿素氮值（BUN ），挤压前及挤 压后 1 天检测血肌酸激酶（CK ）。以血肌酐浓度（SCr ）﹥177umol/L 为肾功能 衰竭的标准，比较各组家兔出现急性肾功能衰竭机率及生存情况。 三、兔 BMSCs 治疗挤压伤性急性肾损伤（衰竭）实验 选取体重 2.7~3.2kg 的家兔，予 30kg 重量挤压 3 小时，24 小时后再予 30kg 挤压 3 小时。挑出制模成功的家兔 35 只。随机分为两组，实验组：耳缘静脉输 6 注 BMSCs 细胞悬液 10ml （1×10 /ml ）（n=20 ）；对照组：耳缘静脉输注PBS10ml （n=15 ）。分别于注射 BMSCs 细胞悬液或 PBS 结束后 1d、2d 、4d 、7d、14d、 28d 抽取家兔耳朵中央动脉血 1.5ml，检测血肌酐和尿素氮值。每次抽取血液结 束后，随机从实验组及对照组各取一只家兔，空气注射处死获取肾脏标本，常规 病理切片，HE 染色观察组织学变化。 结果： 一、兔骨髓间充质干细胞（BMSCs ）的分离、培养及鉴定实验 原代细胞呈圆形。贴壁后，细胞呈成纤维细胞样，以集落的形式生长。传代 后细胞增殖速度变快，约 4～6d 就可以长满瓶底。在相应培养基诱导下，可分化 为成脂和成骨等细胞，表达 CD29，CD34，CD90 等抗原，符合 BMSCs 的特性。 其中，P3 代细胞增殖最为活跃。冻存的 BMSCs 复苏后，生长良好。 二、挤压伤性急性肾损伤（衰竭）制模实验 A 组：2 只家兔出现肾功能衰竭；B 组：5 只出现肾功能衰竭，5 只家兔在血 肌酐水平尚未达到肾功能衰竭水平即死亡；C 组：35 只出现肾功能衰竭，7 只家 兔在血肌酐水平尚未达到肾功能衰竭水平即死亡。三组家兔挤压后均血肌酸激酶 （CK ）水平显