龙须菜热激蛋白基因克隆与在高温胁迫下表达模式分析.pdfVIP

谨以此论文献给对我严格要求的导师，给予我无 私关怀的父母和一直支持帮助我的实验室同学们。 ——丁艳 万方数据 万方数据 万方数据 龙须菜热激蛋白基因克隆及在高温胁迫下的 表达模式分析 摘 要 龙须菜是一种重要的大型经济海藻，是生产琼胶的原料，也可以作为鲍鱼的 饵料，具有进行大规模栽培的价值。耐高温品种981和07-2龙须菜的培育，推 动了龙须菜栽培业的发展，但是在实际栽培过程中仍然面临过高的海水温度会限 制龙须菜的生长，导致溃烂甚至死亡等问题。为解决这些问题，培育性状稳定、 耐热性更强的龙须菜新品种是必要的，这需要研究龙须菜对高温的应答机制。研 究表明，热激蛋白 （HSP）是一类在生物体受到逆境胁迫时能提高机体耐受性的 逆境蛋白家族，在减轻逆境胁迫对机体的伤害方面起到很大作用。本论文对龙须 菜热激蛋白进行研究，旨在了解龙须菜的高温胁迫响应机制，为培育抗逆性更强 的龙须菜新品系提供理论依据。 本实验室前期通过构建龙须菜高温胁迫差异表达文库，获得了龙须菜hsp90 的cDNA序列，在此基础上，本论文克隆了hsp90 的全长序列，长为2605bp， 只由一个外显子组成，开放阅读框长2100bp，上游调控序列为505bp。该基因编 码699个氨基酸，含 N端保守的ATPase结构域，中间结构域和C端是保守的 5肽MEEVD。经Blast分析与角叉菜hsp90 的相似性最高，达到87%。该基因序 列在三种耐高温性能不同的龙须菜-野生型、981和07-2龙须菜中序列相同，通 过southernblotting验证该基因在三种龙须菜中拷贝数也相同，均为两个拷贝。 将本实验室前期获得的hsp70-1和hsp70-2与GenBank 中的序列比对，发现 与GenBank 中报道的龙须菜hsp70序列不同，可见龙须菜中还存在第三种hsp70 （命名为hsp70-3），但是对于hsp70-3仅有部分序列报道，在此基础上，本论文 克隆了hsp70-3 的全长序列，长为2780bp，开放阅读框全长 1867bp，基因上游 调控区长416bp，下游侧翼序列长495bp。该基因编码621个氨基酸，含有保守 的N端ATPase结构域和C端底物结合结构域。经Blast分析与细基江蓠hsp70 的相似性最高，达到91%。 本实验还通过分析 10种管家基因—肌动蛋白基因 (ACT)、 甘油醛-3-磷酸 脱氢酶基因(GAPDH)、 延伸因子基因1(EF1)、 转录起始因子基因 (eIF)、 组 I 万方数据 蛋白H2B基因 (H2B)、18S核糖体RNA 基因 (18SrRNA）、转录间隔区基因 （ITS2）、胞色素c氧化酶基因 （COX）、细胞色素还原酶b5基因（CR）、藻红 蛋白基因 （PEB）在不同温度胁迫下的表达情况，获得了龙须菜在温度胁迫条件 下合适的内参基因：a)32℃不同的热激处理时间实验，最适合的内参基因组合是 eIF 和 ACT。b) 8℃不同的低温处理时间实验，最适合的内参基因组合是 GAPDH、ITS2、CR、18SrRNA。c) 不同的处理温度实验，最合适的内参基因组 合是 eIF、 EF1、 ACT 。d) 龙须菜不同的生活世代实验，最合适的内参基因 组合是 GAPDH和 ACT。 采用荧光定量PCR 的方法检测hsp90和hsp70-3在高温（32℃）胁迫下在野 生型，07-2，981 中的转录水平。hsp90在三种龙须菜中的变化趋势是一样的， 均呈现先升高后降低再升高的趋势；从表