人类睾丸高表达新基因ZNF474小鼠同源基因Zfp474分离鉴定和初步功能的分析.pdf

摘 要 生精障碍是导致男性不育的重要因素之一。原发性无精症和少精 子症约占男性不育的20％左右。精子生成是一个复杂的过程，有多个 基因参与的基因网络的调控，这些基因可能既存在于性染色体上，也 存在于常染色体上J基今为止，尚未克隆出特异性的生精相关和睾丸 发育基因。分离新的睾丸发育、精子生成相关基因能进一步了解生殖 细胞发生机理和生物学过程，对阐明精子发生的机制具有重要的生理 和病理学意义。 (ESTs)，它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建 的eDNA文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。应用多种数据 分析软件分析不同组织来源的EST数据库，能获取许多有价值的信 息资源。 Differential “数字差异展示”(Digital Display，DDD)方 法是通过计算机对不同文库进行比较，发现在统计学意义上存在明显 转录差异的基因的定量分析方法。我们利用DDD软件、借助公共ESTs 数据库，从筛查人类睾丸中有高表达而在其他组织中不表达或低表达 的差异ESTs入手，结合实验验证成功克隆了一个人类睾丸组织高表 f ＼ 要实验方法及实验结果如下： 第一部分：数字差异展示方法克隆人类睾丸组织特异性表达基因 ZNF474 数字差异展示是一种利用Unigene数据库中的ESTs进行数种平 行材料之间的比较的方法。我们挑选4个人类睾丸组织来源的eDNA B)，215个人类其他组织或细胞株来源的 序列文库作为检测子(pool A)，运用数字差异展示，进行两种 eDNA文库序列作为驱赶子(pool 不同来源的平行材料之间的比较，分析代表各基因的EST在各组文 库中出现的频次。通过poolB：poolA之间的比值来计算倍数差异， 并以≥10倍的差异为筛选标准，获得在统计学意义上存在差异表达 的克隆重叠群。 通过比较共获得两组文库间有统计学意义的差异表达EST族共 473个，其中在非睾丸组织来源EST文库中高表达的有110个，余下 的363个在睾丸组织来源EST文库中高表达。同源匹配分析显示代 表已知基因序列的ESTs有132个，可分为如下几类：睾丸发育相关 蛋白，精子相关蛋白，热休克蛋白家族，细胞周期相关因子，转录因 子，锌指蛋白及一些激酶等。 通过数字差异展示获得的睾丸组织文库高表达的231个EST族中， 对Hs．127963进行分析。运用EST拼接工具进行序列匹配、整合，该 EST族中包含的EST拼接后获得一个长度为1972bp的序列。利用 131ast检索nr数据库，认为该序列代表一个新基因。经多组织的 Northemblot和RT．PCR表明该基因在已检测组织中具有睾丸组织高 表达的特征。新基因经人类基因命名委员会(HGNC)命名为ZNF474 II (zinc protein finger 显示利用数字差异展示分离睾丸组织特异性表达基因是成功的。 第二部分：ZNF474基因生物信息学分析与功能的初步研究 生物信息学分析显示ZNF474基因定位在5q23，包含2个外显子， 基因组跨越30．1kb。该基因cDNA全长为1972 bp，编码由364个氨 基酸组成的、分子量为40314．9Da的蛋白，与已知蛋白质无明显同源 性。Northern blot结果显示新基因在睾丸组织高表达，转录本大小为 2．37Kb。ZNF474蛋白无信号肽序列和跨膜区序列，最大可能是一种 锌指蛋白结构域。 为研究ZNF474基因在人睾丸组织不同发育时期的表达特征，分 别收集入胚胎98天、4个月和8个月，以及成人睾丸组织。RT．PCR 结果显示ZNF474基因在98天、4+月、8+月胚胎睾丸组织中表达量维 持在较低水平，到成人阶段达到最高。许多在睾丸中表达的基因经常 具有细胞类型特异性或发育阶段特异性，反映了组织在发育过程中的 需求。原位