DNA提取原理和方法..pptVIP

低温时有利于质粒沉淀，但相应盐也会大量沉淀. 4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。 低温下DNA溶解度小。 所以要用70%乙醇洗涤DNA沉淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶),用无水乙醇则达不到这个目的!OK? 4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时 TE为Tris-HCl和EDTA的混合液，EDTA可以螯合金属离子和DNase，Tris-HCl可以维持一定的pH，以稳定DNA结构. 质粒大小，菌株，纯化方法 RNA 大肠杆菌染色体DNA 的污染 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合,进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后, 超螺旋度大为增加, 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多溴化乙锭,直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别,线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同 使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚 糖 中的β-1，4糖苷键 NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的PH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化； 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。 NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液。用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液，调回PH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA，RNA，以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内 在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。 但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失 其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。 LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA , PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段 以CsCl超速离心纯化为例，内毒素分子度与质粒-EB复合体在CsCl中的密度几乎相当，因此纯化得到的DNA中内毒素污染依然存在。 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr; Proteinase K : 作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。 4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; 优点：1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNA Phenol： Chloroform： 1.加速有机相与液相分层。 2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 有助于分相，使离心后的上层含DNA