《Npu DnaE内含肽构建及其对293T细胞高效反式剪接活性分析 Construction of Npu DnaE intein and its highly efficient protein trans-splicing activity in 293T cells》.pdfVIP

些丕医药2Q!兰生筮主兰鲞筮丝塑 DnaE内含肽构建及其对293T细胞 Npu 高效反式剪接活性分析 张矫，崔文静，马祥敏，王雯雯，王欣 (天津医科大学附属肿瘤医院，乳腺癌防治教育部重点实验室， 天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060) 摘要：目的构建NpuDnaE内含肽，探讨NpuDnaE内含肽是否在293T细胞中具备高效反式剪接活性。方法 微镜下观察目的蛋白Venus是否形成。48h后收集细胞蛋白，应用Westernblot技术进一步印证。结果构建的质 粒经限制性内切酶鉴定及测序比对正确，转染293T后可见共转染细胞组出现明亮荧光，弥漫分布于细胞质中， Western blot证明高量目的蛋白Venus形成。结论成功构建NpuDnaE内含肽，其能在293T细胞中发挥反式剪接 的生物学功能，并具有高效的剪接效率及功能目的蛋白形成率。 关键词：NpuDnaE；内含肽；蛋白质反式剪接 doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2013．44．004 中图分类号：R34 文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2013)44-0010-04 Constructionof DnaEinteinandits efficient Npu highly proteintrans-splicing in293Tcells activity ZHANG Xin Jiao，C明Wen-jing，MAXiang-min，WANG耽n—wen，WANG Cancer to Medical (TianfinHospitalAffiliatedTianjin University，KeyLaboratory BreastCancerPreventionand the of Therapyof MinistryofEducation，Tianjin CancerPreventionand Laboratoryof 300060，China) Key Therapy，Tianfin ToconstructDnaEinteinandto that DnaEhave efficient trans- Abstract：ObjectiveNpu proveNpu highly protein in293Tcells．MethodsWeinsertedthe fusion andNDc·Vcinto splicingactivity preparedgeneVn—NDn·myc pCDH- CMV—MCS—EFl一Purovectortoconstructthe the wastransfectedinto293T thatweob— plasmid，thenplasmid cells，after tofindthe ofVenuswith collectedthe after48 servedthe fluorescence hours targetprotein product microscope．Weprotein andfurther theVenus Westernblot．ResultsTherecombinantwasverified di- proved proteinbyusing