《嗜冷杆菌EastSeaG5-1415脂肪酶基因的克隆和序列测定 Cloning and Sequencing of Lipase Gene from P. glacincola EastSeaG5-1415》.pdfVIP

高技术通讯 年 月 第 卷 第 期 2005 2 15 2 嗜冷杆菌EastSeaG5-1415 脂肪酶基因的克隆和序列测定! ! ! ! 卜宪娜 孙 谧 郝建华 郑家声 （中国海洋大学海洋生命学院 青岛266003） （ 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛266071） ! 摘 要 从东海深海底泥中筛选到一株产低温碱性脂肪酶的海洋细菌EastSeaG5-1415，经 鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola 。将其染色体DNA 用 Sau3AI 部分酶切后，低熔点 琼脂糖回收2 ~ 10kb 的DNA 片段，用KIenow 大片段酶半补齐，与用Sal I 酶切半补齐的质 粒pUc19 连接后，转化 E . coli . JM109 构建基因文库。用平板测活法从基因文库初步筛选 到两株产碱性脂肪酶的阳性克隆，采用ELISA 反应进一步鉴定。序列测定分析表明，两个 重组质粒中都包含长度为 的碱性脂肪酶基因的完整开放阅读框架（ ）和上游基 951bp ORF 因调控序列。此片段编码有 317 个氨基酸组成的酶，计算分子量为 35 000 DaI 。通过 Southern 杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌 Psychrobacter glacincola EastSeaG5-1415 基因 组。 关键词 嗜冷杆菌，低温碱性脂肪酶，基因克隆，序列测定 M-1 的碱性脂肪酶基因在各种宿主菌中进行了表 0 引 言 达，并将来源于假单胞菌属的已被克隆和测序的17 个种或属的脂肪酶基因按照氨基酸序列的同源性进 脂肪酶（ ， ），又称三酰基甘油 Lipase Ec 3 . 1. 1. 3 ［］ 3 行了分类。在低温脂肪酶方面， 等 将 FeIIer G 酰基水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇 Moraxella TA144 的低温脂肪酶基因在 Escherichia 形成的甘油三酸酯酯键的酶，它普遍存在于动植物 ［］ 4 coli 中进行了表达研究。国内学者对扩展青霉 和 体和微生物中。本世纪初发现的以碱性脂肪酶为主 ［］ 圆弧霉菌5 碱性脂肪酶基因以及类产碱假单胞菌耐 的微生物脂肪酶得到了广泛的研究。微生物脂肪酶 ［］ 6 热性脂肪酶基因 进行了克隆和在大肠杆菌中的表 种类多且具有比动物脂肪酶更广的作用pH、作用温 达研究，但未见对低温脂肪酶基因方面研究的报道。 度范围和更多对底物的专一性类型，又便于工业生 由于脂肪酶通常在较高温度下才呈现酶活性，因而 产以获取高纯度制剂，同时微生物脂肪酶在酶理论 具有低温活性的脂肪酶以其独有的优势正越来越成 研究和实际应用中也发挥着作用。脂肪酶作为一种 为各国研究的热点。尽管如今对其性质以及结构等 重要的工业酶，可应用于油脂水解、食品风味和香味 方面有一定了解，但都是零星的，还不够全面，只有 的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性、 很少几种低温脂肪酶基因得到克隆和测序。 添加于洗涤剂和化妆品中等。特别是在油脂化工和 中国水产科学研究院黄海水产研究所从东海深 有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能 海底泥分离得到一株产低温碱性脂肪酶（ Marine Iow- 低、原料要求低、成品质量高等优点。 temperature aIkaIine Iipase， ）的海洋细菌 MLTAL East- 近几年，国内外学者对微生物脂肪酶的基因工 ，经鉴定为嗜冷杆菌（ SeaG5-1415 Psychrobacte . glacin- 程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。 cola ），由于长期生活在低温环境中，该菌产生的酶具 ［］ 1 Gotz F 等 克隆了Staphylococcus hyicus 的脂肪酶基 有低温催化和对热不稳定性的特征，其酶活性的最 因并在Staphylococcus carnosus 和Escherichia coli 中进 适温度移向低温并在低温下（ ）仍保持高比例 0 ~ 4 C ［］ 2 行了表达研究。 等 将 的活性，因此被称为低温碱性脂肪酶。低温碱性脂 Gijs Pseudomonas alcaligenes 计划（ ）和中国水产科学研究院科研基金（ ）资助项目。 # 863 2001AA625070 2003-5-1 女， 年生，硕士；研究方向：遗传学。 ! 1979 联系人， ： E-maiI sunmi @ ysfri . ac . cn （收稿日期： ） 2004-05-17 — 94 — 卜宪娜等：嗜冷杆菌EastSeaG5-l4l5 脂肪酶基因的克隆和序列测定 肪酶能在低温环境条件下分解甘油三酸酯酯键，在