《基于工具酶信号放大技术电化学发光法检测凝血酶 Electrochemiluminescence Biosensor for Detection of Thrombin Using Enzyme-based Signal Amplification》.pdfVIP

HUAXUE) 第10期 第40卷 分析化学(FENXI 研究报告 ChineseJournalof 1549～1554 2012年10月 AnalyticalChemistry 基于工具酶信号放大技术电化学发光法检测凝血酶 朱化雨¨ 张利1 陈怀成1’2 闫圣娟1’2 (临沂大学化学化工学院，临沂276005)2(山东宏艺科技股份有限公司分析测试中心，临沂276034) 摘要 利用巯基乙胺将合成的金纳米粒子氨基化；基于纳米粒子负载羧基化的联吡啶钌和巯基DNA制得 电化学发光信号探针；采用酶循环信号放大技术，获得大量含新增DNA的溶液来捕获信号探针；以金电极为 载体，将巯基DNA自组装到电极表面，依次杂交互补DNA和信号探针，构建电化学发光生物传感器。在优化 的条件下，此传感器对凝血酶具有良好的响应，在3．0×lff”～6．O×10。1mol／L范围内，凝血酶的浓度与发光强 度呈良好的线性关系，检出限为1．8×10-”mol／L(3a)。采用酶切循环放大技术制备的生物传感器具有灵敏度 高，选择性和重现性良好等特点。 关键词 纳米粒子；酶循环信号放大技术；电化学发光；凝血酶 1 引 言 癌症患者常有不同程度的出血倾向。肿瘤组织对周围组织侵袭、肿瘤细胞转移以及肿瘤组织和肿 瘤患者血液本身的变化，均可改变患者的凝血机制。衡量凝血机制的重要指标之一就是检测凝血酶的 浓度”1。测定凝血酶的传统方法主要有荧光法吲和发色底物法嘲，但这两种方法的灵敏度均不佳，无法 进行现代医学要求的痕量检测。发展高灵敏度的信号放大技术已成为当前生化分析的重点研究方向。 目前的信号放大技术主要有纳米金信号放大H、工具酶信号放大p81和生物条码信号放大技术㈨01等，已 经广泛应用于核酸‘11】、蛋白质‘11，121和小分子[13，141等物质的检测。同时，新型电化学发光试剂的制备和电 化学发光的应用研究”5~171也备受关注，其在核酸杂交分析、生化物质分析、免疫分析测定以及细胞检 测“引等方面的研究已经取得了很大进展。由于核酸适配体稳定便宜、易合成、可再生，适配体技术”91也 成为蛋白分析的有力工具之一。凝血酶拥有两段不同的适配体，一段有15个碱基(适配体1)，另一段 有29个碱基(适配体2)，能以G四分体的结构形式分别与凝血酶上的不同位点进行特异性结合∞2”。 本研究将纳米技术、酶切循环信号放大技术、适配体技术与电化学发光相结合，研制出高灵敏的生 物传感器(图1)。先通过巯基乙胺使金纳米粒子氨基化，再将羧基化的联吡啶钌和DNA5接人，制成 交，经过与凝血酶作用后，部分DNAl被识别竞争下来，继续杂交DNA3。加入聚合酶等物质时，DNAl 的碱基序列沿37端继续延长，新增长的碱基序列在内切酶的作用下成为新DNA片段，即B；剩余的杂交 片段参与下一个循环，继续聚合、剪切，从而获得大量的新增DNA片段)；在金电极上固定DNA4，其依 次与新增长的DNAB和信号探针A杂交，形成电化学发光生物传感器，实现对凝血酶的高灵敏检测。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 仪器公司)。凝血酶(美国Haematologic 29)，DNA限制性内切 公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，国药集团化学试剂有限公司)；DNA聚合酶(phi 2011—12-09收稿；2012-03—17接受 本文系国家自然科学基金(No和山东省科技攻关项目(No．201011002)资助 +E-mail：hykjgf@163．com 万方数据 1550 分析化学 第40卷 酱等燃祭础+等 洲!!兰竺攀o㈣xtx．tx．txlv。 DNAl DNA3