RPS16家族基因功能的初步的研究.pdfVIP

摘要 ANK6是锚蛋白家族成员，通过其ankyrin锚重复序列介导蛋白 相互作用。本实验室的前期研究发现，ANK6是调控植物受精过程 中雌雄配子识别的关键成员。它在线粒体中通过与转录起始因子 SIG5相互作用，控制植物中雌雄配子体识别的这一过程。ANK6不 仅定位在线粒体，还定位在细胞核中。因此，进一步筛选与ANK6 互作的蛋白，对于研究ANK6调控雌雄配子识别的分子机制，以及 探讨ANK6在细胞核中的功能，都具有重要的意义。 在前期工作中，运用酵母双杂交技术，以ANK6为“诱饵”， 筛选拟南芥的cDNA文库，获得了一个新的与砧岖6互作的蛋白序 列，它是核糖体小亚基蛋白RPSl6家族成员I心S16C的N端氨基酸 RPSl6C。它们的基因序列以及蛋白序列的同源性很高。 为了进一步证明I冲S16与ANK6之间的相互作用，我们利用荧 光双分子互补技术，证实RPSl6家族成员的全长序列与伽岖6在拟 南芥细胞核中相互作用。而且，应用酵母双杂交技术，我们发现三 个I冲S16家族成员与触岖6相互作用的部位都在其N端(～71aa)。 奇怪的是， RPSl6成员全长蛋白在酵母系统中并不能与ANK6发 生相互作用，这有可能是拟南芥的I冲S16蛋白在酵母中不能正确折 叠导致其N端功能区失活所致。 通过GFP标签分别构建RPSl6A／B／C的融合表达质粒，再分别转 进拟南芥的原生质体，在荧光显微镜下观察到荧光信号都在细胞核 中，表明RPSl6家族的三个成员定位在拟南芥细胞的细胞核中。为 进一步确定RPSl6家族成员的亚细胞定位，我们还分别构建了RPSl6 家族单个成员带GFP标签的过表达转基因植株。在激光共聚焦显微 镜下，观察到发出绿色荧光的部位能与通过细胞核核荧光染料DAPI 染色的信号完全重合，证明了RPSl6家族的三个蛋白都定位在拟南 芥的细胞核中。 应用带GUS标签的质粒，分别构建含RPSl6家族成员启动子 序列的融合表达质粒，获得转基因植株。对I心S16家族成员的启动 子活性的研究发现，RPSl6A与I冲S16B在拟南芥的根、叶、花丝、 花药以及柱头中有明显表达，而RPSl6C则在拟南芥的根与叶中表 在功能上存在冗余。 I冲S16家族各成员的T-DNA插入突变体及过表达植株，在正常 和高盐、渗透等胁迫环境下，其表型与对照野生型拟南芥都没有明 显差异，这也可能暗示着RPSl6家族成员功能上的冗余。目前正在 构建它们的双突变体以及三突变体。 本研究对于阐明PRSl6和ANK6的生物学功能有重要参考价 值。 关键词：A1暇6、酵母双杂交技术、I冲S16家族 ABSTRACT The member ANK6，a of鲫崎mn r印eatproteinf．amily，mediates interaction its motifs．Our protein。protein throughankyrin repeat datahaVe mat theANK6 acent】ral preVious proVen plays r01ein male—female indouble gamete recognition ANK6 male—fIemale in regulates g锄eterecognitiOn the process mitochondria wimme initi