脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白疫苗预防高脂喂养小鼠胰岛素抵抗及其动脉粥样硬化的实验的研究.pdf

脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白疫苗预防高脂喂养小鼠胰岛素抵抗及动脉粥样硬化的实验研究 摘要 [背景] 随着社会的不断发展和人们生活方式的改变，大量脂肪摄入所引发的肥胖及其相 关代谢性疾病尤其是2型糖尿病的发病率J下逐年上升，严重危害着人民群众的身心健 康。肥胖和糖尿病可能带来一系列生理功能的改变，其大血管并发症如动脉粥样硬化 更是直接威胁生命，从而加重任何原因引致死亡的风险。传统治疗方法如控制饮食、 加强运动、内科药物及外科手术等，均或多或少存在着难以坚持、依从性差、手术并 发症和远期效果不明确等种种弊端。因此，对于上述疾病的治疗还需另辟蹊径。 目前已有大量研究证据表明，脂肪组织除了储存能量之外，还是一个重要的内分 泌器官，能够释放大量生物活性物质入血，并通过局部和全身作用，协调能量代谢、 胰岛素敏感性、炎症和血管反应。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A．FABP，又称FABP4， ap2)就是其中的一种，它属于脂肪酸结合蛋白大家族，主要存在于脂肪细胞和巨噬 细胞，也可以分泌入血，其主要作用是参与游离脂肪酸及其它类型的脂质激素的转运 和合成，从而调节全身胰岛素敏感性及能量代谢活动，并且在巨噬细胞中调节炎症细 胞因子和胆固醇酯的聚集。大量的动物实验和临床研究已经证实，FABP4水平与肥 胖和糖脂代谓}紊乱相关的多种病理状态如高血糖、高胰岛素血症、高脂血症、代谢综 合征、动脉粥样硬化等的发生和发展密切相关， FABP4基因敲除或口服其特异性抑 制剂的小鼠，表现出几乎能够完全抵抗饮食性或遗传性肥胖诱导下的胰岛素抵抗、血 脂紊乱、动脉粥样硬化、脂肪性肝病等。 因此，研究者们认为，从某种程度上抑制FABP4的表达和作用，能够有效改善 外周的胰岛素抵抗，保护胰岛B细胞功能，而且对糖脂代谢和大血管病变产生有益的 效应，它可能成为肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化治疗的新靶点。然而，基因敲除技术 难度高且可行性差，口服抑制剂同样存在难以坚持、依从性差等问题。 [目的] 基于上述理论和实践基础，本研究以与机体糖脂代谢密切相关的蛋白FABP4为 靶点，拟构建能够诱导出针对FABP4特异性中和抗体的治疗性疫苗，主动免疫高脂 喂养下小鼠，观察免疫效果及其安全耐受性，为高脂诱导下胰岛素抵抗及其大血管病 变并发症的预防及治疗新途径提供理论和实验依据。 [方法] 1、采用生物合成的方法表达得到纯化的小鼠FABP4蛋白作为一种蛋白疫苗， 第二军医大学博士论文 为了增加其免疫原性，另选取两种不同的载体与之组成另两种蛋白疫苗，分别是：(1)、 以钥孔戚血蓝蛋白(KLH)为载体的KLH．FABP4蛋白疫苗。 2、分别以三种不同的蛋白疫苗(实验组)及其相应载体或佐剂(对照组)对小 鼠进行免疫，观察小鼠安全耐受性，同时摸索最佳免疫剂量和免疫间隔，通过ELISA 法检测各组FABP4抗体滴度以筛选出最佳免疫方案。 3、选取方法2中筛选出的最佳免疫方案，对高脂喂养下野生型小鼠进行免疫， 并以其相应载体或佐剂为对照，测量小鼠体重、摄食量、血糖、胰岛素、脂联素等指 标，并进行葡萄糖耐量实验；处死小鼠后，取肝脏组织进行油红O染色，比较肝脏 脂肪沉积面积。 E) 4、选取方法2中筛选出的最佳免疫方案，对高脂喂养下载脂蛋白E(Apo E乒)进行免疫，并以其相应的载体或佐剂为对照，测量小鼠体重、 敲除的小鼠(Apo 摄食量、血糖、胰岛素、脂联素、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸 进行葡萄糖耐量实验；处死小鼠后，分离小鼠主动脉进行油红O染色，比较动脉粥 样斑块面积。 [结果] 1、采用生物合成的方法，成功表达了纯化的FABP4蛋白和对照组所需的免疫 验证确实为所需蛋白；采用化学耦联的方法，成功制备了KLH．FABP4蛋白疫苗。为 进一步的小鼠免疫打下了良好基础。 2、三种候选蛋白疫苗分别免疫小鼠后，均可产生FABP4特异性抗体，而作为 对照的HBc组、KLH组和佐剂组则没有FABP4特异性抗体的产生，说明这三种蛋 白疫苗均能够打破宿主对自身对FABP4的免疫耐受。其中，FABP4组小鼠产生的抗 的间隔时间，各组抗体滴度于第3轮加强免疫后达到平稳状态。免疫过程中，各组均 有部分小鼠存在免疫接种局部轻度脱毛和皮下硬结现象，无其他显著不良事