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第20章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广 HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用； 流动相种类较多，选择余地广； 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用； 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性。 1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。 正相色谱——固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。 反相色谱——固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。 上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。 20.2 高效液相色谱仪 液相色谱仪 液相色谱仪 组成 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统 现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500-2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。 主要部件 1. 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵 梯度洗提装置 梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。 2. 其他类型泵 气动放大泵又称为恒压泵，其工作原理与水压机相似，以低压气体作用在大面积气缸活塞上，压力传递到小面积液缸活塞，利用压力放大获得高压。 螺旋注射泵又称为排代泵，其结构类似于医用注射器，由一个大体积液体室和柱塞组成，步进电机通过螺旋杆传动机构推动柱塞输出高压液体。 3.流速控制和程序系统 比例调节阀和混合器；脉动阻尼器；放空阀；过滤器；反压控制传感器等。 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 20.2.4 色谱柱 20.2.5 检测器 紫外光度检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 （2） 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 3. 红外吸收检测器 与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。 20.2.5.2 荧光检测器 20.2.5.3 示差折光检测器 20.3.1. 高效液相色谱固定