啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定.docVIP

浙江工业大学药学院 生物化学实验论文 2013 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖 ，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃50℃，最适ph为4.04.5.  实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂 ①啤酒酵母； ②醋酸钠（AR）； ③甲苯（AR）； ④4mol/L醋酸； ⑤95%乙醇（-20℃）； ⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。 ⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。 注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。 1.2.2器材 ①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）； ②量筒10ml（×1）25ml（×1）; ③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）； ④具塞试管10 ml（×3）； ⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸； ⑥培养箱； ⑦恒温水浴箱； ⑧磁力搅拌器，搅拌子； ⑨高速冷冻离心机。 1.3操作方法 1． 酵母的自溶 ：在弱碱中培养60小时； 2． 初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A； 3． 热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B 4． 乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C 1.4结果与分析 1.4.1结果 表2-1 提取液 颜色状态 体积（ml） A 黄色液体 17.0 B 浅黄色液体 18.0 C 淡黄色液体 8.27 VA总=VA=17.0ml VB总=VB·[VA/(VA-3)]=18.0ml VC总=Vc·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=8.27ml 1.4.2分析 提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。 1.4.3结论 VA总=17.0ml ； VB总=218.0ml ； VC总=8.27ml。 1.5注意事项 ①第一次离心后取液体时要小心； ②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作； ③冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失； 1.6认识与体会 实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离