牛型布鲁氏菌苹果酸脱氢酶酶学性质免疫学特性及研究.pdfVIP

牛型布鲁氏菌苹果酸脱氢酶酶学性质 及其免疫学特性的研究 微生物学硕士研究生童永亮 西南大学动物科技学院王豪举副教授 中国农业科学院上海兽医研究所于圣青研究员韩先干副研究员 捅要 性传染病，该病在世界范围内广泛流行并严重危害着人畜健康。布鲁氏菌在宿主 体内生存能力极强，在巨噬细胞内具有极强的繁殖能力以及防止杀伤的自我保护 能力，但其不具有经典的毒力因子且不能引起强烈的先天性免疫，因而给布鲁氏 菌的防治带来了很大的困难。体内诱导基因涉及病原菌在体内的生存和致病过程， 本研究对本实验室筛选、鉴定的布鲁氏菌体内诱导抗原一苹果酸脱氢酶的酶学特 性及生物学功能开展研究，探讨MDH在布鲁氏菌致病过程的机制。 本研究以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板，通过PCR技术扩增出牛型布鲁 氏菌MDH的编码基因胁肠纪抛咖绷口sP∽l砌)，测序结果表明，该基因大小为 8．1)序列loo％同源。 936bp，与NCBl上公布的布鲁氏菌2308(登录号：NC挪761 融合蛋白His．MDH。通过优化表达条件，His．MDH主要以可溶性方式表达，利用 行纯化，为进一步研究该蛋白的酶学性质及免疫学特性奠定了基础。 苹果酸脱氢酶(MDH)是三梭酸循环中的一个关键酶，MDH以NAD+为辅因子， 催化苹果酸赫与草酰乙酸盐的相互转化。本研究对表达、纯化的布鲁氏菌MDH的 酶学性质进行了初步研究，结果表明：在体外催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的酶促 反应中，最适pH值为6．O，反应最适温度为42℃，在50℃以下酶的稳定性较好， Vmax为0．91(umolml‘1min‘1)。 生物信息学分析表明，该酶为四聚体，单体存在N一端的NAD结合区、催化 区及C一端尾区三个结构域，同时也存在与底物结合位点，疏水结构易形成酶的口 袋结构，通过对不同细菌MDH的酶学活性位点分析，对布鲁氏菌MDH可能存在 的酶活位点进行预测。以重组质粒pET．28a—MDH为模板，采用熏叠引物延伸PCR l 过诱导表达与纯化，成功获得六个点突变的重组MDH。通过对MDH酶学活性的 比较测定，结果发现除D178V点突变对酶活基本无影响外，其它五个点突变都可 以使酶活完全丧失。 W钨tem Blot检测结果表明，重组His．MDH能与布鲁氏菌阳性牛血清发生特 异性反应，表明MDH具有免疫原性。用His．MDH作为包被抗原，对临床收集的 30份布鲁氏菌阳性牛血清进行EUSA检测，结果所有被检血清均为阳性反应，表 明MDH可作为潜在的用于牛型布鲁氏菌感染诊断的靶蛋白。生物信息学对MDH 的氨基酸一级序列抗原性、亲水性、表面可及性以及柔韧性等指标的分析，一共 预测了8条B细胞线性表位。此外，对MDH的亚定位结果表明，MDH为膜相关 蛋白；纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性分析以及布鲁氏菌感染的Hela细胞实 验表明：MDH蛋白具有纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性，参与布鲁氏菌对宿 主细胞的入侵过程。 本研究通过对布鲁氏菌苹果酸脱氢酶酶学性质以及免疫学特性研究，对阐述 MDH参与布鲁氏菌致病过程中的作用提供依据，为进一步基于MDH在牛型布鲁 氏菌在诊断、药物及疫苗研究提供理论基础。 关键词：牛型布鲁氏菌；苹果酸脱氢酶：酶学性质；定点突变；免疫学特性 n 1一 ·● ● ● ● ● ● ■ ● J●■● CnaraCterlZanon0t EnZymatlCannlmmUnol02lCal of A19 Malate Bruce¨aabortusstrain dehydrogenase Candidate：1Y．ongliang’Iong