RNA干扰cx43基因对培养的人RPE细胞的作用及蛋白质组学分析.pdf

军医进修学院博十论文 题目： RNA干扰0x43基因对培养的人RPE细胞的作用 及其蛋白质组学分析 中文摘要 背景和目的：实验证明RPE在多种缝隙连接蛋白中主要表达cx43，cx43 能够在细胞间形成缝隙连接，从而促进细胞间的信息交流，这种信息交流和 连接蛋白本身对RPE的增殖、分化、移形等细胞行为均有影响，而RPE功能 和结构的正常是维持视网膜色素上皮层完整性和生理功能的重要因素，其异 常与多种眼病的发生有关，因此，我们希望通过RNA干扰的方法研究cx43 对RPE的生物学作用，并且通过蛋白质组学方法分析cx43基因被干扰后的蛋 白质表达变化，为治疗相关的眼病提供可能的途径或策略。 实验方法：1、培养原代的人RPE细胞，经过细胞角蛋白(ck)、S-100 和神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学鉴定后，通过AO／PI染色 技术确定培养细胞的存活率，描记其生长曲线，第3-5代用于以下细胞实验 2、生物合成针对人cx43基因的三条小干扰RNA和一条阴性RNA通过脂质体 转染RPE细胞后，通过RT-PCR的方法确定抑制效率最高的干扰片断3、将该 片段以不同浓度通过阳离子脂质体转染培养的人RPE细胞后，采用MTT法观 察其对细胞的增殖力的作用；通过流式细胞仪观察其对细胞周期的影响；通 blot观 过扫描电镜观察其对细胞形态的影响；通过免疫细胞化学和Weston 察其对cx43蛋白表达的作用；采用激光共聚焦和荧光淬灭恢复技术观察荧光 恢复速率平均百分率，评价其对细胞间通讯功能的影响；通过制作RPE细胞 损伤模型，观察其对损伤修复能力的作用4、分离纯化转染siRNA的RPE组 和正常对照组RPE细胞的全部蛋白质，应用等电聚焦电泳和SDS双向电 泳技术，银染显示分离出的蛋白质斑点，经凝胶图像分析软件对两个样本进 行胶图分析，寻找差异蛋白点。胶内酶解差异表达的蛋白点，基质辅助电离 质数据库并鉴定蛋白质，分析其生物学意义。 结果：1、原代培养的细胞呈多角形，包含大量色素，容易传代，色素随 3 军医进修学院博+论文 着传代次数逐渐减少。免疫细胞化学染色：ck和S-100抗体染色阳性，阳性 细胞率≥94％，GFAP抗体染色阴性，可以确定是高纯度的上皮来源的色素细 胞即视网膜色素上皮细胞。AO／PI染色活细胞比率96％，细胞生长状态良好， 传代后笫3、4天细胞处于对数生长期，平均6天传代一次。2、通过RT-PCR 证实三条生物合成的SiRNA均能抑制人RPE细胞cx43基因的转录，抑制效率 进细胞的增殖，差异有统计学意义(p0．01)，其促增殖作用有浓度依赖性， 浓度为1．25ug／ml时达到饱和，促增殖作用最强，增殖率为146％，细胞平均 5天传代一次；抑制cx43基因后，S期细胞比率明显增多，差异有显著性 (p0．05)；细胞的扫描电镜显示转染SiRNA后，细胞表型发生变化，细胞 体积增大，表面触手增多；免疫细胞化学显示体外培养的人RPE细胞表达 浅，48h后染色明显变。通过计算机图像分析系统显示48h后cx43染色强度 降低76％；与Weston blot结果一致，转染24h后，cx43的蛋白表达下降， 48h明显抑制cx43的表达，抑制率达到62％；cx43基因被干扰后，细胞荧光 恢复速率降低，细胞间通讯功能明显降低；细胞损伤修复能力下降4、通过 银染的方法在RPE组三块胶中分离出共有的蛋白质斑点861个，组间匹配率 达到92％；转染siRNA组三块胶分离出共有的蛋白质斑点887个，组问匹配 率达到93％。经过软件图像分析，发现Volume值改变≥2．0的点共78个。其 中上调的16个点，下调的1 8个点，有19个点在RPE上存在，而转染组不存 在，25给在转染组存在而RPE组不存在。随机选取了7个点进行蛋白质谱分 in表达下 降，VDAC在转染siRNA后出现表达。 结论：RNA干扰是一种高效的特异性基