SSH技术筛选家蝇抗感染差异基因及其抗菌肽时相表达模式研究.pdfVIP

SSH技术筛选家蝇抗感染差异基因及抗菌肽时相 表达模式的研究 硕士研究生 王 艳 导 师 朱家勇 教授 中文摘要 蝇类属节肢动物门，昆虫纲，双翅目，环裂亚目，其免疫防御系统不同于脊椎 动物，一般认为不存在适应免疫。近年来，人们也开始在蝇类中探索免疫系统的起 源和进化，为研究昆虫天然免疫和人类的天然免疫的相关性提供依据。蝇类在长期 的进化过程中形成了自身独特的免疫机制，即缺乏哺乳动物所具有的适应性免疫系 统，体内没有T细胞和B细胞，也没有抗体、补体系统。那么，它们在受到外界病原 生物侵袭时，其分子免疫机制及效应免疫分子的表达情况是怎么样的呢？本文拟采 用SSH、Real-time PCR等技术，以家蝇（Musca domestic ）为材料，就此问题进行初 步探讨。 1. 家蝇最佳感染条件的确定。用三种常见的生物致病菌即金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ）、大肠杆菌（Escherichia coli ），球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuill），感染家蝇，观察其感染后的性状变化及存活率。发现它们引起家蝇有效感 染的LC 10 9 50分别为金葡菌（cells/ ml ）LC50 约为10 cells/ ml ，大肠杆菌为大于10 cells/ ml ，球孢白僵菌为OD600值1.98的菌浓度。 2. 抑制性消减杂交(SSH)结果及分析。成功构建了家蝇抗感染差异表达cDNA 文库。 文库扩增后进行PCR 鉴定，挑取252 个白色阳性克隆，表明插入片段主要分布在 250~750bp之间。应用反向Northern斑点杂交技术从消减cDNA文库中高通量筛选了35 个差异表达的克隆，其中32个为真阳性。得到252个测序后，根据在GenBank非冗余 核酸数据库(nr)和EST数据库中BLASTn序列比对结果，代表已知基因的ESTs按照基 I 因功能分为八类：信号转导与细胞间通信、细胞结构与运动、细胞凋亡、细胞与机 体防御、物质转运、翻译与表达调控、代谢及其它。结果显示：家蝇具有与哺乳动 物相似的急性期免疫反应基因表达（如 proteases inhibitor, respiratory burst, lysozymes and antimicrobial peptides, etc等）其表达模式也是相同的，但是存在于脊椎动物中的 一些典型的急性期反应蛋白，如C-reactive protein、serum amyloid P 和 serum amyloid A 却未能在家蝇中发现，这又体现了这两类物种面对不同环境和微生物的选择压力 可能采取不同的策略。家蝇具有与哺乳动物相似的急性期免疫反应基因，这为利用 家蝇来研究免疫系统的进化提供了进一步的有力证据。但是，与脊椎动物相比，家 蝇也有着一些其他的参与急性期免疫反应的基因，进一步研究这些发现的新基因将 有助于人们深入了解免疫系统起源和进化的分子基础。 3. 代表免疫效应分子抗菌肽的时相表达模式研究。抗菌肽做为蝇类体液免疫效 应分子的重要组成部分，我们对不同生长阶段卵、一龄、二龄、三龄、蛹、成虫， 诱导后不同时期家蝇三龄幼虫抗菌肽基因进行表达模式分析。结果显示三种抗菌肽 在家蝇体内为组成性表达。在诱导后不同时间点，不同发育阶段抗菌肽均普遍表达， 但表达水平存在着明显的差异，诱导后表达明显升高。 关键词：家蝇，抗感染免疫，抑制性消减杂交，实时定量PCR II Study on Differential Expression Genes of Musca domestica Defense against the Infection by SSH and Expression Patterns of Antibacteri