Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的信号转导机制的研究.pdf

摘要 骼肌生长发育的负调控因子。本研究旨在以小鼠成肌细胞系C2C12细胞为模型，探 研究共包括以下五部分实验： 实验一Myostatin对JNK信号途径的影响 径产生影响并确定其最佳添加浓度，首先利用不同浓度的重组鼠Myostatin蛋白处理 C2C12细胞，1h后收集细胞提取总蛋白，利用磷酸化JNK抗体进行Westernblot分 加浓度后，为进一步研究细胞在增殖和分化过程中Myostatin是否对INK信号途径产 生影响及了解这种影响是否具有时间效应，分别在增殖和分化两种培养条件下利用 胞提取总蛋白，利用多种抗体进行Western blot分析。结果表明：增殖过程中，细胞 min出现轻微提高，在1h达到最大，随后逐 内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20 rain出现第一次提 渐下降；分化过程中，·细胞内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20 h；细胞增殖 高，在40rain回落到对照组水平，在1h后出现第二次提高并持续到4 下游信号分子)进一步所证实，并且细胞内c-Jun磷酸化水平的变化具有与JNK磷酸 化水平变化相类似的规律；细胞增殖和分化过程中，JNK总蛋白水平在各处理前后维 号途径。 实验二Actmm在Myostatin激活删(中的作用 对照GAPDHsiRNA确定的最佳脂质体转染条件，将三对用于下调ActRIIB基因表达 siRNAID 1621 的siRNA(Ambion59935、ID60120或ID14)转染到C2C12细胞中， 48 162114 ID siRNA162114转染到C2C12细胞中，48 h后添加50 处理1h，然后收集细胞提取总蛋白，利用磷酸化JNK抗体进行Westernblot分析。 弱。本实验证实了Myostatin激活JNK是由ActRIIB所介导。 实验三TAKl．Ml∞信号通路在Myostatin激活州K中的作用 用最佳脂质体转染条件，分别将三对用于下调黝朋基因表达的siRNA(Ambion siRNAID94455、ID 94549或ID siRNA (Ambion1I)64447、ID 64539或ID186583)转染到C2C12细胞中，48h后 收集细胞提取总RNA，利用实时荧光定量PCR方法分析细胞内刚同和MKK4基因 表达的变化。结果表明：和对照组相比，Ambion 189006 siRNAID64447、ID“539和ID ID1 siRNA siRNA89006或Ambion 所介导，采用最佳脂质体转染条件，分别将Ambion h， 然后收集细胞提取总蛋白，利用多种抗体进行Westernblot分析。结果表明，高效下 TAKl．MKK4信号通路而激活JNK。 采用MTT法进行细胞增殖分析，结果表明：和对照组相比，添加50 ng／mL重组 Myostatin蛋白处理C2C12细胞24 gmol／L 细胞增殖的能力。Myostatin抑制成肌细胞增殖常与p21基因表达上调密切相关。为 Ⅱ