抗菌肽SMAP-29基因的设计、合成、表达纯化及抗菌活性的检测.pdfVIP

抗菌肽SMAP-29 基因的设计、合成、表达纯化 及抗菌活性的检测 硕士研究生： 韩福郎 导 师： 肖建华 教授 中 文 摘 要 目的： 通过设计合成抗菌肽 SMAP-29 新基因，构建其原核表达载体 pGEX-4T-1/SMAP-29 ，经诱导表达和分离纯化，得到大量具有抗菌活性的抗菌肽 SMAP-29 。 方法： 根据SMAP-29 蛋白质氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，同时兼顾了 其 mRNA 二级结构自由能自行设计全新基因，基因采用 geneSOEing （gene splicing by overlap extension, geneSOEing ）法合成，合成的基因克隆至pGEX-4T-1 原核表达载体中，通过酶切分析、PCR 和测序鉴定筛选出阳性重组质粒；重组 质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3) 中进行IPTG 诱导表达，经GST 琼脂糖FF 层析 柱纯化，同时作凝血酶切割，再经HPLC 分离纯化，获得纯度达 95 ％的目的蛋 白。检测抗菌肽SMAP－29 的抗菌活性，采用微量肉汤稀释法测定其对白色葡 萄球菌（临床株）、粪肠球菌耐药株（耐氟喹诺酮类）、粪肠球菌标准株（ATCC 29212 ）和大肠杆菌（JM 109 ）的MIC 和MBC 值。 结果： 经geneSOEing 法合成的全新基因长109bp （含限制性酶切位点），将其克隆 至pGEX-4T-1 原核表达载体中，通过酶切分析、PCR 和测序鉴定，其序列与所 设计序列完全一致。SDS－PAGE 电泳结果分析表明pGEX-4T-1/SMAP-29 可以 在BL21 中表达大小约29KD 的GST-SMAP-29 融合蛋白，经凝血酶切割和分离 纯化后得到大小约 3.2KDa 的 SMAP-29 目的多肽。微量肉汤稀释法检测表明 SMAP-29 具有较强的抗菌活性。 - 3 - 结论： 通过基因改造和原核融合蛋白表达方式可获得具有抗菌活性的抗菌肽 SMAP-29 。 关键词： 抗菌肽；SMAP-29 ；基因设计；原核表达。 - 4 - Design, Synthesis and Expression of SMAP-29 Gene and Assay the Antibacterial Activity of SMAP-29 ABSTRACT Objectives: The novel gene of the SMAP-29 was designed and synthesized, the recombinant prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-1/SMAP-29 was constructed. After the SMAP-29 gene was overexpressed in E. coli and expression productions were purified, antibacterial activity peptides SMAP-29 were obtained. Methods ： The design of SMAP-29 gene based on the SMAP-29 protein sequence and the bias code of amino acid of E. coli and mRNA secondary structure free energy. The new gene was synthesized via gene splicing by overlap extens