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实验四 细菌革兰氏染色 目的：1、了解细菌革兰氏染色的原理 2、学习及掌握革兰氏染色方法内容： 1、涂片 2、革兰氏染色 细菌染色的目的意义： 细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。 染色的基本原理 1、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性 染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电 荷，能和带负电荷的物质结合。 2、革兰氏染色法所以能将细菌分为G+菌和G— 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所 决定的。 染色剂（染料）： 是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。 染色剂分类： 碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于 染核和异染颗粒等细胞结构。 酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于 染细胞质。 复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色 剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次 氏体。 涂片染色程序：涂片 自然干燥 固定 染色干燥 镜检 大肠杆菌、枯草杆菌 革兰氏染色可将所有的细菌分为两大类，蓝色的革兰氏阳性菌和红色的革兰氏阴性菌。是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。 革兰氏染色步骤为：紫、碘、酒、红四步。1、草酸铵结晶紫染色1-2 min（碱性染料着染）→水洗； 2、革兰氏碘液染1-3 min（媒染剂媒染） →水 洗； 3、酒精脱色30s-1 min（脱色剂） →水洗； 4、稀释的石炭酸复红10-30s（复染） →水洗。 →干燥→镜检。  革兰氏染色时注意事项：1、要用幼龄培养物作革兰氏染色；2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性 革兰氏染色原理： 细菌细胞壁的化学组成和结构不同 。 革兰氏阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。革兰氏阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较高， 经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭酸复红复染后细胞呈红色。 革兰氏染色步骤 思考题：1、革兰氏染色的关键步骤是什么？2、当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？3、进行革兰氏染色时注意那些事项？ 作业：原理、方法、结果、分析讨论及绘图 绘图：绘出用革兰氏染色法染出的细菌形态图要求：视野要圆；细菌的大小要合理；并写出菌名及放大倍数；用铅笔。标出染的细菌种类及颜色。 * * * * 水 涂片 草酸铵结晶紫 碘 液 95%酒精 稀释的 石 炭酸复红 自然干燥 媒染 2-3min 脱色20~30s 固定 初染1min 复染10~30s 干燥镜检 接种环 蒸馏水 * *