DNA测序概述发展史原理.ppt

DNA测序-概述发展史，原理，方法，常见问题分析 DNA测序技术-发展历史 70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记 80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳 2001年完成人类基因组框架图 DNA测序技术-测序原理 化学修饰法测序原理 Sanger法测序的原理 化学修饰法测序原理  化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切 割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合 物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修 饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环 处 DNA断裂。   Sanger法测序的原理 就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直 到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应 构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量 的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需 要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。 终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产 物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高 分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶 片放射自显影或非同位素标记进行检测。  DNA测序技术-方法概述 生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。 DNA测序技术-常见问题分析 质粒双克隆 处理办法：双克隆的现象主要发生在质粒测序中，载体序列的峰型比较单一，插入片段开始出现杂峰；PCR测序也可能出现这种情况，主要是因为有两个以上大小相差不多的片段引起的。对于质粒，出现这种情况有两种可能，一是挑克隆时不小心挑了两个以上的克隆，另外一个原因就是有两个片段同时插入同一个载体，对于前一种情况，重新挑克隆即可，后一种情况，一方面可以重新挑克隆，另外也可以将质粒转化后再挑单克隆，可能会改善。对于PCR 产物，由于大小相差不多，无法用Agarose的方式分离，只有进行克隆后测序 POLY 结构 处理办法：我们在测序结果中经常会出现连续的poly G.C.A.T之后有的中断，有的会出现峰型比较杂乱的情况，无可用序列。这种情况下只有从反向进行测序。 引物不纯或者发生降解 引物与模板有多结合位点 重复序列 模板不纯 碱基发生缺失 测序发生中断 背景较高 * * 测序无信号 处理办法：测序无信号的原因有很多，其中最大的可能性是引物与模板没有结合，这种情况下要先检查模板上是否有引物的位点，建议更换引物或者模板。 PCR双克隆 polyT poly C 处理办法：测序对引物要求比较严格，要求纯度要达到99％以上，如果引物不纯或者发生降解，测序峰图会比较杂乱，无可用序列，这种情况下只有更换引物 处理办法：如果引物与模板有两个以上结合位点，就会出现峰型杂乱无章，无可用序列的现象，这种情况只有更换测序引物，如果是质粒，使用的是通用引物测序，可用换另外的引物或者请客户提供插入片段的引物进行测序，如果是PCR测序，只有用反向引物测序，或者建议客户克隆后用通用引物进行测序 处理办法：样品中出现重复序列，目前来说没有好的办法，只有从反向测序，如果PCR产物中出现重复序列，装到载体里要比PCR产物直接测序要好一些，但对于较长的重复序列，测序还是一个难题，没有什么好的办法 处理办法：主要发生在PCR产物上，一方面可能是产物没有纯化，另外就是纯化效果不好，一般情况下，我们建议客户对PCR产物尽量进行割胶纯化，如果片段相差不大，最好克隆后测序。 缺失一个碱基 缺失两个碱基 处理办法：碱基缺失，主要发生在PCR产物测序中，遇到这种情况，克隆后测序会是一个比较好的解决方法。 处理办法：这种情况通常是由于样品中存在特殊结构，DNA双链无法打开，PCR