微分离分析新方法的研究.pdf

摘要 LIF直接检测法和间接检测法，为芯片微通道里的刺激剂和利尿剂检测提供了依 据。在本章中，首先建立了LIF直接检测的一般方法，构建了包括自动进样器、 分离毛细管和LIF检测器的电泳分离／检测体系，在此基础上，建立了针对麻黄 碱类刺激剂的直接LIF检测方法。以荧光素异硫氰酸酯(FrrC)为荧光衍生试 剂，研究了麻黄碱、庚胺醇、去甲基伪麻黄碱等刺激剂的荧光衍生条件和毛细管 电泳分离条件。由于直接检测法对样品结构有一定要求，在寻求不到合适的衍生 试剂时，间接检测法作为一种通用检测方法显示出了其优越性。本章对用于间接 LIF检测的多种电泳缓冲体系进行了考察，建立了以三乙胺／荧光素／正丁醇为缓 冲体系的间接检测方法，对尿液中的四种酸性利尿剂(依他尼酸、氯噻酮、布美 它尼和苄氟噻嗪)进行了分析。 第四章发展了毛细管柱内的样品预处理方法，主要是微通道固相萃取和固相 衍生方法，并将之应用于尿样中麻黄碱类刺激剂的预处理。本章的创新之处在于： 1)，实现了微通道中固相载体的定位。本章采用紫外光照聚合与匀浆填充法相结 合的方法，在微通道中的任意位置制备了用于样品预处理的，长度可控的固相载 体，制备方法简便易行，无需采用复杂的微加工技术，为将来集成化芯片微通道 中固相载体的定位提供了基础。2)，提出了微通道中的多相载体技术，以此获得 较高的固相萃取和固相衍生效率。本章将多孔聚合物整体床与色谱填料相结合， 制备了多孔聚合物单相柱、多孔聚合物／ODS双相柱和多孔聚合物／GDX．502双相 柱等三种类型的毛细管预处理柱，对低浓度的麻黄碱进行了预处理，结果表明双 相柱的预处理结果要优于单相柱。3)，发展了固相衍生技术，不仅获得了优于溶 液衍生的衍生效果，同时也使固相萃取步骤与衍生步骤顺利衔接，为微通道中的 高效衍生提供了新的途径。4)，首次提出了微波辅助固相衍生方法，将高效的固 相反应与快速的微波辅助反应相结合，使FITC的衍生反应由十几小时缩短至几 分钟，大大提高了样品预处理的速度。围绕样品的纯化、富集和衍生，本章探讨 了不同类型的预柱对简单背景(水溶液)和复杂背景(尿样)中麻黄碱的预处理 方法，确定了以多孔聚合物／GDX．502双相柱对尿液中的麻黄碱进行预处理的最 终技术路线。结果表明，该固相萃取和固相衍生方法能够很好地匹配后续毛细管 电泳分离和激光诱导荧光检测，可检出尿样中10 ng的麻黄碱。该研究为将来兴 奋剂的集成化微流控芯片分析奠定了基础。 第五章对基于毛细管柱的蛋白质固相测序新方法进行了初步研究。蛋白质的 氨基酸排列顺序一直是生命科学研究的重要内容，在蛋白组学研究蓬勃发展的今 天，尤其需要发展多种技术平台，对微量蛋白质进行准确、快速和灵敏的序列分 析。现有的蛋白质测序方法中，最为成熟并广泛应用的是Edman氮端降解测序 法。本章的主要工作就是探讨Edman降解测序法在微通道中实现的可能性，将 摘要 ● 包括多个反应步骤的常规测序方法微型化，为将来在微流控芯片中实现Edman 降解测序集成化方法提供基础。为了实现微通道里的高灵敏度检测，本研究对经 典Edman降解方法进行了改进，探索了以荧光试剂FITC为偶联剂的降解反应。 本章详细讨论了该微分析方法的实施策略，初步确定了从微量蛋白质的固定到转 化产物LIF检测的技术路线，为进一步的测序工作奠定了基础。 综上所述，本论文立足于发展微流量，乃至纳流量尺度上的分离分析新方法， 从样品预处理、色谱／电泳分离和激光诱导荧光检测等方面展开工作，建立了微 型二维分离体系以及兴奋剂的微通道集成化分析方法，并对微通道中的蛋白质固 相测序方法进行了初步研究。 关键词：微通道，激光诱导荧光，多维分离，兴奋剂，集成化。 ● ‘