红树林来源Streptomycessp.OUC6819中Drimentines类化合物生物合成关键酶功能的分析.pdfVIP

万方数据 万方数据 万方数据 红树林来源Streptomycessp.OUC6819 中Drimentines 类化合 物生物合成关键酶功能研究 摘 要 Drimentines 属于一类结构新颖的异戊烯化二酮哌嗪类抗生素，具有抗菌， 抗真菌，抗肿瘤和驱虫活性。本论文以分离自我国广东红树林保护区芦苇根际土 壤之中的Streptomyces sp.OUC6819 为研究对象，对其产生的Drimentines 类化合 物的生物合成途径中的关键酶进行了初步研究，主要进行了以下工作： 首先，对Streptomyces sp.OUC6819 的基因组中NRPS 基因 （簇）进行较为 系统的生物信息学分析。结果发现在染色体上含有7 个可能的NRPSs 基因（簇）， 其中NRPS-1 可能编码一个由13 个氨基酸组成的未知Siderophore 类化合物，然 而其结构的特殊性 （如NRPS 1-A1 ，A4 和A8 中A domains 中K517 缺失）暗示 了该基因簇的功能不完整性；NRPS-2~NRPS-6 只有1 个模块，NRPS-4~NRPS-6 不具有完整的功能结构域组成；NRPS-7 基因簇的编码产物可能由Gly 和Asp 组 成的化合物衍生而来。以上结果说明在Streptomyces sp. OUC6819 中Drimentines 类化合物并非经由典型的NRPS 途径合成而来。 其次，对Drimentines 生物合成过程中的5 个关键基因 （driM ，driO ，driN ， driP 和 driK ）进行了克隆表达。选用不同表达载体 pET-22b(+) 、pET-24a(+)、 pET-30a(+)和pET-32a(+)，构建了蛋白重组表达质粒，并转入不同的表达宿主中 大肠杆菌BL21(DE3) 、Rosetta(DE3) 、Rosetta 和Codon plus ；DriN 、DriP 、DriK 获得可溶性表达，DriN 的表达条件为30℃，IPTG 浓度0.05mM ；DriP 的表达条 件为16℃，IPTG 浓度0.2mM ；DriK 的表达条件为30℃，IPTG 浓度0.05mM ； DriM 表达条件为16℃，IPTG 浓度0.05 mM ，但DriK 的表达量低；DriO 、DriD 无论是克隆到不同表达载体，还是转入不同表达宿主中，都未得到可溶性蛋白。 然后，对酰基载体蛋白DriN 进行了功能鉴定。通过体外生化实验和HPLC 分析，结果表明DriN 能够在Pptase 作用下进行磷酸泛酰巯基乙胺基化，由无活 性的脱辅基（apo- ）形式转为活性全蛋白（holo- ）形式，转化率约48% 。进一步 通过LC-MS 分析，检测了apo-DriN 与holo-DriN 的分子量，通过计算，两者之 I 万方数据 间的分子量差异符合之前的推断，这再次证明了DriN 可能是Drimentines 生物合 成过程中的酰基载体蛋白。 最后，对DriM 的功能进行了初步的研究，利用DriM 在活化氨基酸过程中 释放的焦磷酸，使用焦磷酸试剂盒检测DriM 的催化能力。通过对 14 种氨基酸 的检测结果表明，DriM 具有比较宽泛的底物识别能力。 以上研究结果一方面通过Streptomyces sp.OUC6819 中NRPS 基因（簇）的 系统生物信息学分析，为NRPs 化合物的基因组采掘提供了重要理论指导；另一 方面通过关键酶的体外生化实验为阐明Drimentines 生物合成分子机制奠定了必 要的基础。 关键词：Streptomyces sp.OUC6819；Drimentines ；生物合成；非核糖体肽类合 成酶；