营养因素对奶牛卵母细胞体外发育和克隆效率的影响.pdf

摘要 。 I II I—I j i ． 1．1i_皇皇曼皇皇曼皇曼皇曼曼曼量曼曼 曼--；i，。亏一111wil i一．一． 一。 摘要 奶牛体细胞核移植技术在加速品种改良、结合转基因技术生产珍贵医用蛋白 等方面有着广阔的应用前景。但目前克隆效率低、流产率高、后代存活率低和出 生后代发育异常等成为该项技术广泛应用的瓶颈。导致这一瓶颈的因素很多，其 中现有卵母细胞体外培养系统不能使卵母细胞，特别是卵胞质达到成熟和激活方 法不能完全激活核移植后的重构胚是两个重要因素，这两个因素能引起核移植后 核质互作出现异常，导致重构胚不能正确的实现重编程。因此，完善奶牛卵母细 胞体外成熟培养系统，优化核移植后卵母细胞的激活方法，成为提高核移植效率 的两个关键环节。 本研究依据现代细胞营养学理论，形成了一种无血清、化学成分明确的奶牛 卵母细胞体外成熟培养液，并优化该培养液成熟培养的奶牛卵母细胞的激活条件。 以体外培养的奶牛耳部成纤维细胞、输卵管上皮细胞及卵丘细胞为供体细胞，进 行体细胞核移植证实了上述奶牛卵母细胞成熟培养液和激活方法的可行性。同时， 研究绿茶多酚对IVF及NT植前胚胎体外发育的影响及机理，为提高核移植胚胎 体外发育率提供理论依据。 1．奶牛核移植供体细胞系的建立 采用组织块贴壁法从奶牛耳部组织分离成纤维细胞，采用机械法分离奶牛输 卵管上皮细胞，利用含血清的DMEM／F12培养液对两种细胞进行原代和续代培 养：用胰蛋白酶消化液从卵泡中抽取的卵丘．卵母细胞复合物分离卵丘细胞，利用 改良的McCoy’s5a培养液进行原代和续代培养。传代纯化后分析三种细胞的形态 特征、体外生长曲线和染色体核型，结果表明，三种细胞的形态正常、体外生长 曲线符合正常细胞的一般规律、染色体核型正常，均可作为体细胞核移植的供体 细胞。 2．无血清、化学成分明确的奶牛卵母细胞体外成熟培养液的优化 用PVP-40代替血清，建立了一种化学成分明确的卵母细胞体外成熟基础培养 捅要 -- iN m } !II I_。m _ T mmm：mmm_-一-- mM、1．5mM、5．6mM 液(SOFaa．PVP．40)，分别单独将不同浓度的葡萄糖(O 和20mM)、IGF·I(O ng／mL、50ng／mL、100ng／mL和150ng／mL)、GTPs(0IxM、 10州、15pM和20pM)添加到基础培养液中，对奶牛卵母细胞进行ⅣM、IVF 和IVC，以筛选三种物质适宜的添加浓度。结果表明，获得最高卵裂率和囊胚率的 mM，100 葡萄糖、IGF．I*EIGTPs添加浓度分别为5．6 ng／mL、15肛M。将三种物质以 优化的浓度同时加入到基础培养液中，构建一种无血清、化学成分明确的优化培 养液(Optimized 液培养后的卵母细胞体外成熟率、卵裂率、囊胚率及细胞内GSH含量。结果表明， 所构建的卵母细胞优化培养液可以代替传统的TCM．199+FBS培养液用于奶牛卵 母细胞的体外成熟培养，并提高了成熟后卵母细胞的囊胚发育率(39．2％vs．30．4％， P0．05 o卵母细胞发育能力的提高与细胞I内GSH含量的增加有关(14．3pmol／oocyte VS．8．9 直径为3-6I／lln的卵泡采集卵母细胞，可以获得较好的卵母细胞数量、体外成熟率、 体外受精后卵裂率及囊胚率。 3．奶牛卵母细胞激活条件的优化