犁头尖凝集素（Typhonium+divaricatum（L.）Decne+agglutinin）的纯化、性质的研究、分子克隆及其表达.pdf

agglutinin)的纯化、性质研究、分子克隆及表达 植物学专业 研究生：吴传芳 指导老师：陈放鲍锦库教授 摘要 天南星科植物犁头尖是我国传统中药，其根状茎中含有一种凝集素，命为 divaricatum(L．)Decne 犁头尖凝集素(Typhonium 层析等方法分离得到TDA蛋白纯品。性质研究发现TDA具强的兔血细胞凝集素 u 活性，在浓度为0．95 KD：等电聚 g／ml时仍能凝集兔红细胞；分子量为48 焦结果显示，TDA的等电点大约为4．5和6．5，表明TDA是由两个不同亚基组成 的四聚体。糖抑制实验结果显示甘露聚糖肽，卵粘蛋白，去唾液酸糖蛋白和猪 甲状腺球蛋白对TDA的凝血活性有很强的抑制作用，表明TDA是甘露糖特异性 结合蛋白质。 研究不同温度和pH对TDA的兔红细胞凝集活性的影响，结果表明TDA是 一种对热，对酸碱相对稳定的蛋白质。TDA对金属离子也不依赖。 采用荧光淬灭方法研究TDA蛋白质溶液的构象，表明不带电荷的极性淬灭 剂丙烯酰胺能淬灭100％的色氨酸的荧光，阴离子淬灭剂KI和阳离子淬灭剂 于分子表面，小部分埋藏于分子内部疏水环境中，这与荧光光谱的结果是一致 的。 用荧光光谱法研究了脲、盐酸胍和SDS三种变性剂在不同浓度下构象的变 化和凝血活性的变化情况。研究发现三种变性剂均导致TDA结构的改变破坏活 性中心，使得凝血活性下降，甚至丧失。 采用基团特异性化学修饰剂对TDA的特定氨基酸残基进行修饰，结合其凝 血活性的变化，并通过荧光光谱学手段研究TDA分子构象的变化。研究发现色 后，TDA的凝血活性分别保留33．3％、40％、60％和70％，表明这几种氨基酸 是TDA凝血活性的必需基团，参与了凝血活性中心的氨基酸组成或位于中心附 近参与维持其必需的空间构象，修饰后导致活性中心的破坏或所需的构象破坏， 从而引起凝血活性的下降。荧光光谱显示这些基团修饰后荧光强度都有不同程 度的下降，最大发射峰位置也相应变化，表明修饰导致蛋白质构象变化。而且 通过计算得之每分子TDA中含2个色氨酸残基。组氨酸(His)，天冬氨酸／谷氨 弱，说明修饰后TDA分子的活性中心的构象没有变化，只是这些氨基酸的修饰 导致色氨酸所处的微环境变化。 对肿瘤细胞的作用显示，TDA对前列腺癌Pro—Ol细胞系的抑制作用较强， Hela细胞系则不具有抑制作用。在抗病毒方面，结果表明TDA对Vero细胞的 半数毒性浓度(CC。)为5．716 u 度(IC；。)为3．054 g／ml。说明TDA在低浓度下即可有效抵制HSV—II对正常 细胞的感染，且TDA对Vero细胞的毒性很低。 1 通过其它甘露糖结合凝集素基因的序列比对设计简并引物，利用3’RACE 和5’RACE的方法克隆得到了该基因全长序列。该cDNA全长1145 bp，开放阅 读框长813 bp，编码271个氨基酸的前体蛋白。通过序列的分析可以发现该蛋 白含有两个结构域，即其前体蛋白含有：信号肽序列、结构域1、连接肽、结 构域2和c一末端剪切序列。蛋白结构域1和2分别由106和108个氨基酸组 成，分子量为12KD左右，等电点分别为5和7．13。TDA与天南星科其它凝集 素的同源性较高，但与其不同的是TDA仅有两个典型的甘露糖结合位点盒。二 级和三级结构分析发现他与GNA的结构非常相似。密码子的偏爱性分析发现TDA 中不存在稀有密码子，可直接用于大肠杆菌的表达。因此，该基因的克隆，为 深入研究TDA结构基因，剪切机制，表达和调控机制以及其结构与功能的关系 奠定了重要的基础。 将编码犁头尖凝集素(TDA)去除信号肽部分的前体蛋白的片段定向克隆到 pQE一30质粒后，获得重组质粒。陔重组质粒转化大肠杆菌M15菌株，通过菌落 检测融合蛋白的表达情况。结果表明，