Caveolin-1对小鼠肝癌细胞转化、凋亡及其N-聚糖分支合成的调节作用.pdf

Caveolin．1对小鼠肝癌细胞转化、凋亡及 N．聚糖分支合成的调节作用 博士研究生：汪淑晶 指导教师：张嘉宁 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 胞膜窖(caveolae)是50-100nm烧瓶状的细胞膜结构，和信号传 导密切相关。窖蛋白．1(caveolin．1)是胞膜窖的主要结构成分，在细胞 内吞、胆固醇运输、信号传导、肿瘤转化中发挥着重要的作用。Caveolin．1 (Cav．1)在肿瘤中是发挥抑癌作用还是促癌作用一直存在争论。在大多 数肿瘤细胞如乳腺癌、肺癌、卵巢癌中发挥抑癌基因样作用，而在少数 肿瘤如前列腺癌中则发挥癌基因样作用。然而目前对Cav．1在肝癌细胞 中所发挥作用的研究尚少，对于Cav．1介导肝癌细胞凋亡、侵袭和转移 的分子机制亦不十分清楚。 呈高表达，且前者高于后者，在Hepal．6细胞中表达缺失。其中Hca—F 具有高侵袭、高淋巴道转移潜能，Hca．P具有低侵袭、低淋巴道转移潜 能，Hepal．6无转移潜能。因此推测，Cav．1的表达可能在小鼠肝癌细胞 恶性表型转化中发挥重要作用。大量的实验已经表明，肿瘤细胞的恶性 行为很大程度上是由细胞表面形成过量的p1，6GlcNAc分支结构，进而产 生多天线的N．糖链结构，从而改变了糖蛋白分子的生物学性状，使肿瘤 细胞的生物学行为发生改变。然而，Cav．1是否影响小鼠肝癌细胞N．糖 蛋白的pl，6GIcNAc分支结构，有关报道较少。 蛋白超家族的跨膜糖蛋白，由于N．糖基化程度的不同，表现为分子量不 1 同的高糖型(HG．CD 147 47)和低糖型(LG．CDl47)。已有研究证实，CD 在许多恶性肿瘤细胞中有表达，并能诱导基质金属蛋白酶产生，从而影 响肿瘤细胞的侵袭和转移。 l47向 HG．CDl l 47的转化。然而，CD47在不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌细 胞株中的糖链结构如何，Cav．1表达是否对CDl47糖蛋白糖链的分支结 构产生了影响，Cav．1如何调节CD147的糖基化，有关报道甚少。 本文在利用分子克隆、基因转染及RNA干扰等技术上调和下调 Cav一1表达的基础上，1)观察Cav．1表达变化对小鼠肝癌细胞转化、凋 亡、侵袭和转移等生物学行为的影响：2)阐明Cav．1介导小鼠肝癌细胞 凋亡、侵袭和转移的分子机制；3)分析CDl47在小鼠肝癌细胞株中的 糖型结构，并初步探讨Cav．1对N．糖蛋白分支结构的调节作用。本研究 实验结果如下： 基因已正确插入pEGFP。N2表达载体中，且与载体上的GFP基因处于同 一开放阅读框，记为pEGFP．N2／Cav．1。 利用脂质体转染技术，G418筛选获得2个稳定表达外源Cav．1的 实，外源Cav．1基因整合到Hepal．6细胞基因组中。免疫细胞化学和电 镜结果显示，Cav．1在Hepal．6细胞胞膜和胞浆中均有表达。 2．Cav．1表达上调或下调对小鼠肝癌细胞转化及凋亡的影响 软琼脂克隆形成实验和体内致瘤实验结果显示，与转染空载体组细 胞集落形成数和体内成瘤能力明显增加(P0．05)。 RT．PCR和Western．blot结果显示，与scrambled 够有效下调Car．1在小鼠肝癌H22细胞中的表达，并可持续至转染后3 周左右。致瘤实验和TUNEL实验结果显示，与对照组细胞相比， 成数明显减少，体内成瘤能力下降，凋亡数增多(PO．05)。 3．Car．1在放线菌素D诱导小鼠肝癌细胞凋亡中的作用及分子机制 Hoechst 33342染色结果显示，放线菌素D可诱导小鼠肝癌细胞发生 凋亡，呈时间和浓度依赖性。TUNEL结果显示，Cav．1过表达减少放线 数目，并增强Hca．F细胞对放线菌素D的敏感性。 ，